屎肠球菌的制备工艺研究

徐凯，袁志超，詹泽涛，秦雷，葛宏贺

（武汉新华扬生物股份有限公司，武汉 430086）

屎肠球菌的制备工艺研究

徐凯，袁志超，詹泽涛，秦雷，葛宏贺

（武汉新华扬生物股份有限公司，武汉 430086）

试验旨在开发出一套稳定成熟的屎肠球菌制备工艺，以活菌收率为指标，进行离心、喷雾干燥和包衣工艺的优化。试验结果表明，屎肠球菌的最佳离心工艺为离心转速5 000 r·min-1，离心时间10 min；最佳干燥载体为糊精；喷雾干燥的工艺为进风130℃，出风70℃；包衣的包材选择为1%海藻糖。试验通过离心工艺、喷雾干燥工艺和包衣工艺的优化，开发出一套稳定的屎肠球菌制备工艺。

屎肠球菌；喷雾干燥；包衣；海藻糖

微生态制剂作为一种新型的饲料添加剂，发展非常迅猛，主要原因在于全球各国都开始重视抗生素滥用所造成的危害，在全球无抗化的过程中，微生态制剂作为抗生素的替代物得到了越来越多的重视[1-3]。屎肠球菌（Enterococcus faecium）具有优良的生物学特性，可以在肠道中迅速形成优势菌群，通过生物夺氧、生物颉颃，增加有益菌数量，抑制有害微生物的繁殖，增强机体免疫功能，促进营养物质消化吸收，达到提高生长性能、促进动物健康生长的目的[4-5]。目前我国的研究都集中在发酵工艺的研究和应用领域上，本文主要是针对后处理工艺进行研究，通过对离心工艺、喷雾干燥载体及温度、包衣材料的筛选进行优化，以期能够研究出一条成熟的屎肠球菌后处理工艺。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种

屎肠球菌，来自新华扬生物酶研究院菌种室。

1.1.2 发酵液

发酵液由发酵工艺室提供。

1.1.3 主要试剂及原料

YPD培养基、玉米淀粉、海藻糖、普鲁兰多糖、HPMC、PEG4000等。

1.2 试验设备

离心机、流化床包衣机XYT-Ⅲ、离心式喷雾干燥塔LPG-5、湿热箱。

1.3 试验方法

发酵液经过离心后，加入载体混合均匀制备成待干燥液体，经过喷雾干燥后筛分出需要的粒径大小颗粒，备用；配制好包衣液，对颗粒进行包衣实验，最后计算收率。

活菌计数：采用固体平板YPD培养基计数。离心收率：经等量无菌水混匀菌泥后1 mL的菌数/离心前菌液1 mL的菌数×100%。

干燥收率：干燥后活菌/干燥前理论活菌× 100%。

包衣收率：包衣后活菌/包衣前理论活菌×100%。

耐热存活率：湿热后活菌/湿热处理前活菌× 100%。

2 结果与讨论

2.1 离心工艺

不同离心转速和离心时间对离心收率的影响见表1。

菌体细胞的收集方法很多，离心是其中一个比较传统和成熟的方法，但是不同的菌体对离心过程中产生的离心力耐受性不同，离心转速过高会导致菌体的死亡增多，而离心转速过低会造成上清液中菌体分离不够完全，因此在离心转速和离心时间两方面需要进行试验，以期能得出一个最优的离心工艺。

表1 不同离心转速和离心时间对离心收率的影响

由表1可知，在离心转速转速为5000r·min-1，离心时间为10 min，离心的收率最高，为99%，基本上没有损失。分析原因可能是过高的离心转速产生的离心力较大，对菌体造成伤害，导致其死亡；而过低的转速离心力小，菌体不能完全沉淀下来，导致收率降低。

2.2 干燥工艺

2.2.1 不同载体对屎肠球菌喷雾干燥后储存稳定性的影响

2.2.1.1 常温保存实验

不同载体常温条件下优化结果见表2，常温条件下粪链球菌（不同载体）的存活率见图1。

表2 不同载体常温条件下优化结果

图1 常温条件粪链球菌（不同载体）的存活率

将菌泥稀释10倍后加载体喷干，理论发酵液活菌数为128亿个，理论喷干样品活菌数为64亿个。表2和图1的结果中可知，不同载体喷干后的样品在常温下放置0、1和4周后菌体存活率有明显的区别。常温放置1周后糊精和海藻糖做为载体得到的样品中菌体的存活率相对较高，存活率分别为66.41%和67.34%。试验操作过程中观察可知，糊精作为载体的样品收率最高，更好喷干，海藻糖作为载体在放置过程中有结块现象出现。

2.2.1.2 45℃加速保存实验

不同载体加速（45℃烘箱）条件下优化结果见表3，加速条件下（45℃烘箱）粪链球菌（不同载体）的存活率见图2。

加速实验的样品选择在45℃烘箱中进行放置，通过提高温度加快菌体的死亡，从而进一步探究不同载体制备粪链球菌的稳定性。从表3和图2可知，不同载体样品之间的存活率差异较大，糊精和海藻糖作为载体的样品菌体存活率相对较高。并且随着在烘箱（45℃）中放置时间的延长，菌体存活率呈现下降的趋势，放置24 h后以糊精和海藻糖作为载体的样品菌体存活率分别为61.41%和65%，与常温下放置1周的结果相吻合。综合考虑产品收率、成本以及菌体存活率，选择糊精作为后续项目实验样品制备载体。

表3 不同载体加速（45℃烘箱）条件下优化结果

图2 加速条件下（45℃烘箱）粪链球菌（不同载体）的存活率

2.2.2 喷雾干燥温度对活菌存活率的影响

不同温度对喷雾干燥塔干燥后样品存活率的影响见表4，不同进风/出风温度下制备得到样品的存活率见图3。

由表4和图3的结果可知，当干燥温度较低时，菌体的存活率较高，但是干燥温度过低则干燥量较低，这会导致产能过低。控制出风温度为70℃时，随着进风温度从110℃升高到160℃，菌体的存活率呈现先增加后减少的趋势，最适温度出现在约130℃；控制进风温度为160℃，改变出风温度为80℃，菌体的存活率有明显下降，表明出风温度不宜过高，但也不能过低，出风温度是样品能否成功喷出的关键参数之一。最后综合考虑选择进风温度130℃，出风温度70℃喷雾干燥的条件。

表4 不同温度对喷雾干燥塔干燥后样品存活率的影响

图3 不同进风/出风温度下制备得到样品的存活率

2.3 包衣工艺

不同包衣材料对活菌耐热性的影响见表5。

由表5可知，包衣可以将活菌包裹在一层保护膜下面，使其免受高温高湿环境的影响。不同材料保护性能也有差异，因此在前期实验的基础上筛选了几个载体对已筛分过的屎肠球菌颗粒进行包衣实验，得到样品后对其进行耐热性评价。在湿热环境下（85℃，10min），海藻糖对屎肠球菌的保护作用是比较好的，存活率达到了40%（在微生态存活率的概念中，只要有菌体存活就可以在肠道中定植），在后续的实验中可以对其用量进行优化。

表5 不同包衣材料对活菌耐热性的影响

3 结论

从结果可知屎肠球菌的最佳离心工艺为离心转速5 000 r·min-1，离心时间10 min，最佳干燥载体为糊精，喷雾干燥的工艺为进风130℃，出风70℃，包衣的包材选择为1%海藻糖。

[1]刘秀梅,聂俊华,王庆仁.多种微生物复合的微生态制剂研究进展[J].中国生态农业学报,2002,10（4）:80-83.

[2]王前光,高惠林,刘秋.微生态制剂的研究进展及其在养猪生产上的应用[J].饲料广角,2010（24）:45-47.

[3]王浩波,敖明,哈斯,等.饲用微生态制剂使用过程中存在的问题及解决措施[J].畜牧与饲料科学,2011（2）:78-79.

[4]王婷婷,李爱科,易建明,等.饲用屎肠球菌的筛选、鉴定及其生物学特性[J].中国粮油学报,2013,25（3）:89-93,97.

[5]文静,孙建安,周绪霞,等.屎肠球菌对仔猪生长性能、免疫和抗氧化功能的影响[J].浙江农业学报,2011,23（11）:70-73.

Study on the Preparation ofEnterococcus Faecium

XU Kai,YUAN Zhichao,ZHAN Zetao,QIN Lei,GE Honghe

（Wuhan Sunhy Biological Co.,Ltd.,Wuhan 430086,China）

This study aimed to develop a stable and mature preparation process of Enterococcus faecium.The living bacterium yield as the index and the test optimizd the spray drying process,centrifugal process and coating process.The result showed that the best centrifugal process was centrifugation speed 5 000 r·min-1,centrifugation time 10 min,the best drying carrier was dextrin.The process of spray drying was as follows:inlet air 130℃,outlet air 70℃, coating material package 1%trehalose.We could developed a stable excrement enterococcus preparation process throughthe way of optimizationthe spraydryingprocesscoating andcentrifugalprocess.

Enterococcus faecium;spray drying;coating;trehalose

S816.7；Q939.121

A

1001-0084（2016）11-0031-04

2016-10-10

徐凯（1987-），男，湖北黄冈人，硕士，工程师，主要从事发酵工程的研究。