环境对水稻花时的影响和花时调查统计方法的改进

张萌张华丽戴冬青 李西明 马良勇

（中国水稻研究所，杭州310006；#共同第一作者；*

通讯作者：ricemaly@163.com）

环境对水稻花时的影响和花时调查统计方法的改进

张萌#张华丽#戴冬青 李西明 马良勇*

（中国水稻研究所，杭州310006；#共同第一作者；*

通讯作者：ricemaly@163.com）

花时在杂交稻制种中有着关键作用。明确环境对水稻花时的影响，选择合适的花时调查统计方法可以加快对花时性状的研究。本文以早花时突变体eft、正常花时材料日本晴（NIP）以及构建的eft/NIP重组自交系群体为材料，通过分期播种亲本，明确了温度和光照对花时的影响规律；提出了一种以亲本为标准的改进的水稻花时调查和统计方法。基于该改进的花时调查和统计方法，能有效减弱环境因素对花时性状的影响，可将样本间的花时误差由原来的0～30 min缩减至0～5 min，为水稻花时性状的遗传研究提供较为精确的数据。

水稻；花时；温度；日长；调查统计方法

水稻（oryza sativa L.）是典型的自花授粉作物，水稻的稳定高产在保障粮食安全中有着至关重要的作用。然而在水稻的生长周期中，病害、虫害、干旱及高温等都会造成其最终产量的显著下降[1]。在水稻开花期，超过32℃的高温会引起小穗不育从而造成大量减产[2-3]。由于全球气候变暖，由高温胁迫造成的水稻减产正逐步成为粮食安全的威胁，而水稻早花时可以有效避免高温等不良天气对受精的影响，从而大大提高结实率[3-4]。随着杂交水稻的广泛应用，杂交水稻种子生产过程中父母本的花时不遇（即父母本开花高峰错位的现象）导致制种失败或制种产量低的问题日益突出[5-6]。特别是近年来随着籼粳亚种间杂种优势利用研究的不断深入，一批强优势的“粳不籼恢”（不育系偏粳，恢复系偏籼）组合如“甬优”、“春优”和“浙优”系列的育成，为大面积水稻高产带来了新的机遇。但“粳不籼恢”制种产量普遍低下，严重制约了这些强优势组合在生产上的广泛应用[7]。究其原因，主要是因为粳稻不育系往往柱头不外露或外露率较低，只能在不育系开花时接受同时开花的恢复系的花粉[8-12]。然而，由于不育系本身的生理特性，开花时间比正常的品种晚，而籼稻又比粳稻开花早约1 h，造成“粳不籼恢”制种父母本严重花时不遇，从而制种产量低[6，13-15]。因此，遗传育种家越来越重视水稻花时的研究。

但是，由于水稻花时的差异，不仅与遗传因素有关，而且还受到环境和人为因素的影响[16]，花时的调查困难成为制约花时研究的关键。影响花时的环境因素主要包括温度、湿度、光照、风力及CO2等。其中，环境因素中对父母本花时影响最大的是温度。前人的田间观察研究结果表明，一天的平均气温影响开花的早晚，高温利于开花提早[2，17-19]。因此，本文通过分期播种的方法明确温度对花时的影响规律，并基于这一规律改进了花时调查统计方法，以期为水稻花时的遗传研究提供精确可靠的数据，为今后水稻及其他植物的花时研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

早花时突变体eft：从春江06（CJ06）和TN1所构建的DH群体中发现的早花时突变体（eft），在海南3月中旬抽穗，开花时间为上午9∶00～9∶30，比正常籼稻早2 h左右；在杭州8月上中旬抽穗，开花时间为上午7∶00～7∶30，比正常籼稻开花早约1.5～2 h；9月上中旬则在9∶00左右开花，比正常籼稻早约2 h。

正常花时亲本日本晴（Nipponbare，NIP）：典型粳稻，相同环境下比eft的花时迟1.7～3.5 h，平均约推迟

2.5 h。

重组自交系群体（F10）：2008年夏利用早花时突变体eft和典型粳稻品种日本晴杂交，获得F1杂交种子并于当年冬季种植于海南陵水南繁基地；收获F2种子，并于2009年夏种植于中国水稻研究所富阳试验基地；其后通过单粒传的方法，在杭州和海南加代，至2015年获得农艺性状稳定的F10群体，包含184个株系。

表1 亲本eft和NIP的花时记载情况

所有材料均种植于中国水稻研究所富阳试验基地，每株系2行，每行6株，单本种植，常规栽培管理。

1.2 试验方法

水稻开花在一瞬间完成，精确的记录每个开花瞬间相对困难。花时的研究一般以群体的盛花时研究为主，调查多采用目测法，即以小区为单位观察记录水稻开花高峰。花时的调查和数据的统计对花时性状研究的精确性和可靠度有着至关重要的作用。

1.2.1 环境影响花时规律的研究

杭州属长日照，该重组自交系在此长日照下抽穗期较为分散，持续时间较长，如重组自交系群体中最早的株系抽穗期为7月27日，最迟的株系9月23日才抽穗。此段时间内，包括气温、湿度、光照等的外界环境不断变化，水稻花时也随之变化。为排除此时段内外界环境对花时的影响，必须清楚环境如何影响花时。亲本采用分期播种，自4月29日起，每隔6 d播种1期，共播种7期。日本晴的生育期较短，开花时间从7月25日的9∶05到8月28日的10∶30；eft的花时记载则从7月28日的7∶20到9月25日的9∶40，持续到整个RIL群体抽穗期。除雨天外连续记录2个亲本的具体花时，每5 d取1个平均值作为该段时间的花时，并对eft的花时与温度和日照长短分别进行相关性分析。

水稻开花期温度等环境数据的获得：通过网站http∶//richurimo.51240.com获取试验地点的日平均温度、最高温度、最低温度和昼长（日照长短）数据。

1.2.2 花时性状的调查

2015年夏，调查杭州F10花时性状，采用单株目测动态调查的方法。根据真实花时不断变换调查时间，使记载数据与真实花时相近，减少人为因素的干扰。例如，上午9∶00调查时发现株系1已达盛花，不能确定该株系早在9∶00之前多久盛花，第2天提早5 min左右调查，若株系1未开或未达盛花，则将该株系花时记为9∶00；反之，第3天继续提早5 min于8∶50左右调查，若株系1未开或未达盛花，则将该株系花时记为8∶ 55；反之，继续提前5 min调查，直至发现该株系未达盛花为止。此方法必须保证调查这几天天气变化不大，若中间天气不符，可选择剔除不一致天气的记载数据，以避免环境变化对调查产生的误导。每个株系均连续调查5～7 d，以期得到更接近真实花时的数据。本研究中水稻盛花时标准定为每株系（2行12株）每丛有3朵以上颖花开放。

1.2.3 花时数据的统计

本研究中花时目测法调查的花时性状数据基本接近真实花时，但是整个重组自交系（RIL）群体抽穗期历时较长，使每个株系开花时间的差异不仅取决于遗传因素，同时受气候环境变化的影响，没有一个统一的标准，无法将所记载花时数据作为QTL定位数据，故在改进调查方法的基础上改进花时统计方法。将分期播种的亲本花时作为同一生育期RIL群体各株系的统计标准，以减少环境的干扰。

本试验新创建了不同于前人分级统计法[20-21]的花时差统计法，即调查重组自交系花时期间，每天采用目测法调查早花时亲本eft花时和重组自交系花时，将同一个生育期的早花时亲本eft作为参考，计算其与同一天开花的株系的花时之差（花时差=某株系的盛花时-同期抽穗的亲本eft的盛花时）作为统计数据，以分钟（min）为单位，为后续遗传分析所用。

2 结果与分析

2.1 温度对花时的影响

从表1可看出，不同时期内，亲本eft和NIP各自的花时相差很大，但是亲本eft的花时均早于同一时期的NIP的花时，二者的花时相差约为1.7～3.5 h。

利用eft的花时以及水稻开花期试验地的气温及日照长短，构建了亲本eft具体花时随环境因素的变化散点图（图1）。从图1整个RIL抽穗期间亲本eft花时与温度、光照等环境因素的变化趋势，可以看出在整个重组自交系抽穗期间，日平均气温逐渐降低，eft花时随之逐渐推迟，昼长则呈现一定斜率下降的趋势，即总体来说，随着时间的推移，温度逐渐降低，日照时数减少，花时推迟。亲本eft花时与温度、日照长短的相关性分析表明，eft花时与日最低温、日平均气温、日最高温、日照长短的相关系数分别为-0.9019**、-0.8429**、-0.7756**、-0.9152**（表2）。表明花时与温度、日照长短均呈极显著负相关，其中日最低温度决定了水稻的初始开花时间，这与一天中气温变化的规律相符。这一结果进一步从数据上直观证明“温度升高，花时提早；日照时数增加，花时提早”的结论[2，17，22]，并且进一步表明最低温度直接影响花时迟早。

表2 亲本eft与温度、日照长度的相关性分析

图1 RIL抽穗期内亲本花时、气温、日照时数的变化

图2 RIL群体花时调查及统计分布结果

2.2 花时调查统计结果

花时调查结束后，将所记载的RIL花时数据，按照每30 min归为一级，分级统计可将184个RIL群体分为9级，其中早花时亲本eft属于第1级，正常花时亲本NIP属于第6级，两者花时差别较大（图2A）。以各株系与eft的花时差作为统计数据的结果见图2B。与分级法类似，花时差法也在中部出现一个波谷，即处于eft花时与NIP花时之间有个时间段，达盛花时的株系数明显较少（图2B）。

2.3 与前人调查统计方法的比较

前人花时的研究多采用分级目测法[20-21]。万国等[21]将花时调查周期控制在30 min，并将花时分为6级，9∶30以前定为第1级，9∶31～10∶00为第2级，10∶01～10∶30为第3级，以此类推。而本试验将花时性状的调查统计方法分割成两个独立的部分，即目测调查和花时差统计，调查时尽量使记载数据接近真实花时，统计时又尽可能减少环境的影响。2种调查统计方法并没有实质性差别，最大的不同在于精确度。前人所采用的花时分级研究方法相对较为粗糙，不仅没有考虑到环境对花时的影响，而且花时的绝对误差在0～30 min之间，与真实花时的差距有大有小，两个相邻花时级数的株系真实花时差在1～59 min，同一级数的株系真实花时差也在0～30 min，很难达到一个统一的标准；而本研究改进的花时目测法根据真实花时随时更改调查时间，多次追踪调查，使调查结果更为精确，绝对误差仅在几分钟之内，更加接近真实花时，改进的花时统计法只需计算早花时亲本eft与每个株系的花时差，此数据直接作为统计数据用于后续分析，这一方法使花时数据保持原貌，使表型数据值更加丰富，可能会使花时QTL定位更为精确。

3 讨论

本研究表明，虽然整个重组自交系抽穗期内，所调查的亲本花时除了部分数据来自日本晴外，整个生育期完整的花时数据则来自同一材料eft，但花时差异却十分明显，这只能是环境因素所导致的。蒯建敏等[17]研究也表明，气象条件的不一致性是造成同一品种在不同日期间花时差异的重要乃至主要因素。图1表明，温度升高促进花时提早，温度降低则使花时推迟，这与前人的研究一致[8-9，17]；此外，日照时数的减少使花时推迟，这也与蒯建敏等[17]研究结果一致，即日照时数的增加对水稻有促进开花的作用。有趣的是，在9月1日至5日这段时间内，温度上升，花时反而推迟，与正常趋势相悖（图1）。推测有2种可能性：一是存在一个昼长临界点，即在昼长＜13 h时，花时不再随温度的升高而提早，这段时间内花时主要受日照长短的影响，而受温度影响不大；二是花时受温度和日照长短的影响，两种因素相互协调又相互竞争，正常情况下，二者共同调控花时早迟，但当二者发生冲突时，强的一方起主导作用，此时花时主要受强环境因子影响。高温促进花时提早是否存在一个日照时数临界点，还有待于进一步研究。

无论温度和日照如何影响，本研究中两亲本的开花时间差基本固定，启示笔者可以用品种间的时间差来作为区分不同品种水稻的依据，即用目标单株（株系）与同一亲本的花时差来作为该单株（株系）的花时统计数据。

目前用于花时的研究方法主要是点花法[20，23-25]和目测法[17，19，21]。点花法是以穗为单位的调查方法，标记单穗在一定时间间隔内的开花数，一般情况下全部或部分剪除已开颖花，以方便统计下一时段的开花数；目测法则是以小区为单位的调查方法只是观察记录水稻开花的高峰期。二者虽在广泛应用，但是由于人为干扰和温度、日照等环境因素的影响很难得到大量的精确数据，目前花时性状的调查仍是制约花时遗传研究和解决花时不遇问题的主要因素。

本文所提出的经过改进的花时研究方法是在传统的目测法的基础上发展起来的，秉承了目测法高效、快速的优点，同时又极大的避免了传统目测法记载误差过大的缺陷。本方法操作简单、快捷、可靠，与前人方法相比，该方法得到的数据，完全可以满足QTL定位的要求。因此，该改进方法在植物花时研究中将有广泛的应用前景。

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Environment Influence and Improvement of Investigation and Statistical Methods on Flowering Time in Rice

ZHANG Meng#,ZHANG Huali#,DAI Dongqing,LI Ximing,MA Liangyong*
（China National Rice Research Institute,Hangzhou,310006,China;#These authors contributed equally to this work;*Corresponding author:ricemaly@163.com）

Rice flowering time is a critical factor for seed production in hybrid rice.The research of rice flowering time could be promoted by clarification the influence of environment and utilization appropriate investigation and statistical method.In the present study,the regularity of flowering time changing with temperature and day length was clarified though sowing parents by stages.Simultaneously,an effective investigation and statistical method was firstly established to investigate rice flowering time in the field no matter how the environment changes,based on a recombinant inbred line population including 184 lines from the cross between Nipponbare and the early flowering time mutant eft.The improved method could effectively mitigate the influence of environmental on flowering time and reduce the error of flowering time from 0～30 min to 0～5 min.The method may provide more accurate data to study rice flowering time traits in the future.

rice;flowering time;temperature;day length;investigation and statistical methods

S511

A

1006-8082（2016）06-0010-05

2016－09－08

国家“863”计划（2014AA10A604-15）；国家自然科学基金（31071080）；浙江省公益性农业项目（2011C22002）；国家自然科学基金（31501288）；浙江省自然科学基金（LQ16C130002）；中央级科研院所基本科研业务费专项（2014RG003-3）