103个杂交稻亲本白叶枯病和稻瘟病抗性基因型检测

王祯 樊叶杨 庄杰云 朱玉君

（中国水稻研究所国家水稻改良中心/水稻生物学国家重点实验室，杭州310006；*

通讯作者：yjzhu2013@163.com）

103个杂交稻亲本白叶枯病和稻瘟病抗性基因型检测

王祯 樊叶杨 庄杰云 朱玉君*

（中国水稻研究所国家水稻改良中心/水稻生物学国家重点实验室，杭州310006；*

通讯作者：yjzhu2013@163.com）

白叶枯病和稻瘟病是我国水稻生产的主要病害，选育抗病品种是一种经济有效的防治手段。明确抗性基因在水稻品种资源中的分布，将有助于应用分子标记辅助选择培育抗性品种。本研究针对13个重要抗病基因，包括8个白叶枯病抗性基因（Xa1、Xa4、xa5、Xa7、xa13、Xa21、Xa23和Xa26）和5个稻瘟病抗性基因（Pib、Pi2、Pi9、Pi25 和Pita），应用这些基因的基因标记或连锁标记共29个，检测103份杂交稻亲本，初步确定了其等位基因分布和利用情况，为水稻基础材料的筛选及应用提供参考。

水稻；白叶枯病；稻瘟病；抗性基因；DNA标记

水稻是我国重要的粮食作物之一。稻瘟病和白叶枯病是水稻生产的主要病害[1-2]。因此，针对这两种病害的抗性基因定位和克隆一直备受关注。目前，已有超过100个稻瘟病抗性基因被定位，其中22个已经被克隆[3]；有20个白叶枯病抗性基因被定位，其中7个已经被克隆（http://www.ricedata.cn/gene）。利用这些已鉴定的抗性基因，育种家借助分子标记辅助选择培育了多个携带单个或多个抗性基因的水稻抗病新品种，并在水稻生产过程中取得成效[4-7]。应用分子标记辅助选择进行品种抗性改良的关键步骤是如何从丰富的水稻品种资源库中找到合适抗源。研究表明，基因信息库的构建可以为此提供帮助[8-10]。本研究以水稻育种中常用的一些抗性基因为研究对象，包括白叶枯病抗性基因Xa1、xa5、Xa7、xa13、Xa21、Xa23、Xa4和Xa26以及稻瘟病抗性基因Pib、Pi2、Pi9、Pi25和Pita，应用位于基因内部或连锁区间的分子标记鉴定103份杂交稻亲本；分析这些抗性基因的等位基因分布及利用情况，以期为水稻新品种选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 水稻材料

从中国水稻研究所和其他育种单位共征集了103份水稻材料（表1），包括籼型三系杂交稻母本23个（不育系8个、保持系15个），籼型三系杂交稻父本43个，粳型三系杂交稻母本2个，粳型三系杂交稻父本2个，籼型两系杂交稻母本4个，籼型两系杂交稻父本2个，常规籼稻品种8个，常规粳稻品种4个，未定名品系15个。未定名品系均由中国水稻研究所提供，其余材料来源在前期研究中已有介绍[11]。

1.2 分子标记

本文共用到29个分子标记（表2），其中16个用于检测白叶枯病抗性基因，13个用于检测稻瘟病抗性基因。这些标记中，检测Xa1的3个标记RM17499、RM5473和 RM3836，以及检测 xa5、xa13和 Pib的RM17750、RM447和RM208为本研究根据目标基因在水稻品种日本晴基因组上的物理位置筛选获得：先从目标基因两侧选取多个SSR标记对代表性水稻品种进行多态性分析，挑选呈现多个等位基因、带型清晰的SSR标记用于所有103个水稻品种的检测。其余标记来自前人报道[12-28]。

1.3 标记检测和等位基因记录

采用简易法提取水稻基因组DNA[29]。PCR反应体系为5×PCR缓冲液2.0 μL、25 mmol/L MgCl2溶液0.6 μL、2.5 mmol/L dNTP溶液0.8 μL、33 ng/μL上下游引物各1.0 μL、2 U/μL Taq聚合酶（鼎国）0.25 μL、ddH2O 3.35 μL和模板DNA 1.0 μL。PCR反应条件和扩增产物的检测遵循前期报道[30]，根据扩增产物片段大小分别采用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染显色或2%琼脂糖凝胶分离和GelRed（Biotium）显色。等位基因记录以每个基因的抗性材料为对照，当检测到对照等位基因片段时记为1，反之记为0。

2 结果与分析

2.1 白叶枯病抗性基因的检测结果

Xa1是已克隆的NBS-LRR类白叶枯病抗病基因。在RM17499和RM3836座位上未检测到和抗性对照具有相同等位基因的品种，在RM5473座位上检测到8个籼稻品种具有和抗性对照相同的等位基因，分别为6个三系杂交稻母本（中100A、中1A、博B、金23B、印32B和中9B）和 2个三系杂交稻父本（CH238和CH59）。RM5473和其余2个分子标记的吻合度为92.2%。

xa5是已克隆的抗白叶枯病隐性基因。在RM17750和SSR16座位上，未检测到与抗性对照IRBB5等位基因相同的水稻品种。在RM122标记座位上，共检测到16个与抗性对照等位基因相同的水稻品种，与 RM17750和 SSR16检测结果的吻合度为84.5%。

Xa7被定位在第6染色体长臂，具有广谱抗性。检测结果显示，籼型三系杂交稻父本镇恢084、籼型两系杂交稻父本双七占和籼型两系杂交稻母本广占63S分别在3个、2个和1个座位上检测到与抗性对照相同的等位基因；另外，8个已定名的粳稻品种均在RM20595座位上呈现与抗性对照相同的等位基因。B7 和RM20591的吻合度为99.0%，RM20595和其他2个分子标记的吻合度均为89.3%。

xa13是另一个已克隆的隐性抗病基因，位于第8染色体长臂末端。4个连锁标记的检测结果差异较大：在SR11和SR6座位上，分别检测到42个和86个水稻品种的等位基因与抗性对照相同；在RM447座位上，仅中恢161的等位基因与抗性对照相同。

表2 分子标记清单

Xa21是水稻中第1个被克隆的抗白叶枯病基因，来自于非洲长穗野生稻，具有广谱抗性。仅5个品种在PTA248座位上检测到与抗性对照相同的等位基因，分别为4个籼型三系杂交稻父本（中恢218、中恢111、中恢333和中恢8015）和1个籼型三系杂交稻不育系对应的保持系（中2B）。

Xa23是已克隆的来自普通野生稻的抗白叶枯病基因，具有广谱抗性。在03STS1和RM206座位上均未检测到与抗性对照具有相同等位基因的品种。

Xa26是已克隆的LRR类白叶枯病抗病基因，Xa4 是1个尚未被克隆的抗白叶枯病基因，被定位在Xa26附近，形成1个抗病基因簇[31]。在B4座位上，仅16个品种检测到与抗性对照相同的等位基因，其中13个品种为籼稻，包括三系杂交稻母本3个（内香2A、天丰A和中浙A）、三系杂交稻父本6个（R402、中恢111、中恢1176、中恢333、中恢161和恢66）、常规稻2个（中香1号和中香98）和未定名品种Z13-1；另外，3个粳稻品种为两系杂交稻母本广占63S和父本双七占以及三系杂交稻母本春江12A。

这8个白叶枯病抗性基因、16个标记的检测结果及等位基因记录见国家水稻数据中心数据库（http://www.ricedata.cn/marker/xassr.htm）。

2.2 稻瘟病抗性基因的检测结果

Pib是第1个被克隆的抗稻瘟病基因。通过1对互补性显性基因标记Pibdom/Lys145检测，有44个品种的等位基因与抗性对照相同；在连锁标记RM208座位上检测到41个品种与抗性对照具有相同等位基因。在2个座位上存在差异的3个品种中，未定名品种Z11-1 在RM208座位与抗性对照一致，中恢8012和广恢128则在Pibdom/Lys145座位上与抗性对照具有相同表现。

Pi2和Pi9是两个已被克隆的主效广谱抗稻瘟病基因，处于同一个NBS-LRR基因簇内。在NBS2-Pi9座位上检测到22个与抗性对照具有相同等位基因的品种，在PB9-1座位上检测到18个与抗性对照具有相同等位基因的品种，在标记195座位上检测到22个品种与抗性对照带型相同。其中，有13个品种在3个座位上均与抗性对照相同，表明这些品种可能同时携带Pi2和Pi9，包括8个籼型三系杂交稻母本（川香29A、丰源A、内香2A、D优62B、V20B、菲改20B、协青早B和中2B）、1个籼型三系杂交稻父本（先恢207）、2个籼型两系杂交稻母本（株1S和C815S）和2个籼型常规稻（中佳早32和中鉴100）。

Pi25是从谷梅2号中鉴定出的一个具有稳定广谱抗性的抗稻瘟病基因。CAP3/BglⅡ是Pi25的功能标记，在该座位上未检测到与抗性对照相同的等位基因。在与Pi25连锁的4个座位上，有9个品种的等位基因均与抗性对照相同，包括4份常规粳稻（秀水04、春江051、春江057和日本晴）、2份粳型三系杂交稻母本（春江12A和春江16A）、1份粳型三系杂交稻父本（CH89）和2份未定名品种。

Pita是另一个已被克隆的广谱抗稻瘟病基因。在显性标记YL155/YL87（检测抗病等位基因）和YL183/ YL87（检测感病等位基因）座位上，有33个品种检测到与抗性对照相同的等位基因，包括籼型三系杂交稻母本2份（内香2A和中3B）、籼型三系杂交稻父本20份、籼型两系杂交稻母本1份（株1S）、籼型两系杂交稻父本1份（双七占）、粳型常规稻3份（秀水04、春江051和春江057）、粳型三系杂交稻母本2份（春江12A和春江16A）和粳型三系杂交稻父本1份（CH89）。

这5个稻瘟病抗性基因、13个标记的检测结果及等位基因记录见国家水稻数据中心数据库（http://www.ricedata.cn/marker/pissr.htm）。

3 讨论

基因型和表型之间的吻合度与检测所用的分子标记和基因的物理位置有关。一般认为，在基因内部的标记吻合度最高，其次，离基因较近或在基因两侧的标记检测结果也具有很高的参考价值[32]。在前期工作中，笔者应用检测Xa4、Xa21、xa5、xa13和Pi25的连锁标记进行分子标记辅助育种，成功选育出聚合了多个有利基因的候选恢复系[33]，初步验证了所用分子标记可以用于抗性基因的筛选。

在检测的103个水稻品种中，籼型三系杂交稻母本内香2A可能携带6个抗性基因，分别为Xa4、xa13、 Pib、Pi2、Pi9和Pita；籼型三系杂交稻父本先恢207可能携带5个抗性基因，与内香2A相比少了Xa4。通过查询“中国水稻品种及其系谱数据库（http://www.ricedata.cn/variety/）”，发现这2个品种在新品种选育中作为基础材料发挥了重要作用。如内香6A、内香7A、内香8A和内香9A均是以内香2A为背景进行改良育成，另外，以内香2A为母本培育了国稻6号、内香2002、内2优3015、内香2128和内香18等12个籼型三系杂交稻品种；以先恢207为基础材料选育了籼型三系杂交稻父本先恢207选和RB207-1，并与不育系配组获得了Ⅱ优207、湘优207、宜优207和T优207等约20个籼型三系杂交稻品种。这些成果说明，通过抗性基因分布初探有机会筛选到很好的基础材料。

另外，部分基因在这103份水稻品种中检测到的频率很低。在CAP3/BglⅡ（Pi25）、RM17750（xa5）和03STS1（Xa23）座位上没有检测到与抗性对照相同的等位基因，在RM20591（Xa7）和PTA248（Xa21）座位上仅分别检测到2个和5个品种与抗性对照携带相同的等位基因。这种频率分布可能与基因来源有关。上述5个基因中，Xa21和Xa23分别来自非洲长穗野生稻和普通野生稻，xa5和Xa7来源于孟加拉和尼泊尔[34]，Pi25来源于地方品种谷梅2号[35]。在以往品种选育过程中，可能受地域或供体性状等方面的影响，抗性基因的传播应用受到了限制。本研究为这些基因的进一步应用提供了重要的参考。

[1]吴建利，庄杰云，李德葆，等.水稻对稻瘟病抗性的分子生物学研究进展[J].中国水稻科学，1999，13（2）：123-128.

[2]章琦.水稻白叶枯病抗性的遗传及改良[M].北京：科学出版社，2007：1-2.

[3] Ashkani S,Rafii M Y,Shabanimofrad M,et al.Molecular progress on the mapping and cloning of functional genes for blast disease in rice （Oryza sativa L.）：current status and future considerations[J].Crit Rev Biotechnol，2016，32（2）：353-367.

[4]朱玉君，樊叶杨，黄得润，等.分子标记辅助选择在水稻育种中的应用[J].核农学报，2012，26（5）：756-761.

[5] Jiang J,Mou T,Yu H,et al.Molecular breeding of thermo-sensitive genic male sterile（TGMS）lines of rice for blast resistance using Pi2 gene[J].Rice，2015，8：11.

[6] Pradhan S K,Nayak D K,Mohanty S,et al.Pyramiding of three bacterila blight resistance genes for broad-spectrum resistance in deepwater rice variety,Jalmagna[J].Rice,2015,8:19.

[7] Luo Y C,Sangha J S,Wang S H,et al.Marker-assisted breeding of Xa4,Xa21 and Xa27 in the restorer lines of hybrid rice for broadspectrum and enhanced disease resistance to bacterial blight[J].Mol Breeding,2012,30（4）:1 601-1 610.

[8]时克，雷财林，程治军，等.稻瘟病抗性基因Pita和Pib在我国水稻主栽品种中的分布 [J].植物遗传资源学报，2009，10（1）：21-26.

[9]李进斌，李成云，陈艳，等.二十二个抗稻瘟病基因在云南的利用价值评价[J].植物保护学报，2005，32（2）：113-119.

[10]高利军，高汉亮，颜群，等.4个抗稻瘟病基因分子标记的建立及在水稻亲本中的分布[J].杂交水稻，2010（S1）：294-298.

[11]庄杰云，施勇烽，应杰政，等.中国主栽水稻品种微卫星标记数据库的初步构建[J].中国水稻科学，2006，20（5）：460-468.

[12]Blair M W,Garris A J,Iyer A S,et al.High resolution genetic mapping and candidate gene identification at the xa5 locus for bacterial blight resistance in rice（Oryza sativa L.） [J].Theor Appl Genet, 2003,107:62-73.

[13]钟义明，江光怀，陈学伟，等.水稻含隐性抗白叶枯病基因xa5的24 kb片段的鉴定与基因预测 [J].科学通报，2003，48（19）：2 057-2 061.

[14]Porter B W,Chittoor J M,Yano M,et al.Development and mapping of markers linked to the rice bacterial blight resistance gene Xa7[J].Crop Sci,2003,43:1 484-1 492.

[15]Chen S,Huang Z,Zeng L,et al.High-resolution mapping and gene prediction of Xanthomonas Oryzae pv.Oryzae resistance gene Xa7 [J].Mol Breeding,2008,22:433-441.

[16]Chu Z,Fu B,Yang H,et al.Targeting xa13,a recessive gene for bacterial blight resistance in rice[J].Theor Appl Genet,2006,112（3）: 455-461.

[17]Huang N,Angeles E R,Domingo J,et al.Pyramiding of bacterial blightresistance genes in rice:marker-assisted selection using RFLP and PCR[J].Theor Appl Genet,1997,95:313-320.

[18]樊颖伦，陈学伟，王春连，等.水稻抗白叶枯病基因Xa23的RFLP标记定位及其STS标记的转化[J].作物学报，2006，32（6）：931-935.

[19]潘海军，王春连，赵开军，等.水稻抗白叶枯病基因Xa23的PCR分子标记定位及辅助选择[J].作物学报，2003，29（4）：501-507.

[20]马伯军，王文明，赵彬，等.水稻抗白叶枯病基因Xa4的PCR标记研究[J].遗传，1999，21（3）：9-12.

[21]Fjellstrom R,Conaway-Bormans C A,McClung A M,et al.Development of DNA markers suitable for marker assisted selection of three Pi genes conferring resistance to multiple Pyricularia grisea Pathotypes[J].Crop Sci,2004,44:1790-1798.

[22]刘洋，徐培洲，张红宇，等.水稻抗稻瘟病Pib基因的分子标记辅助选择与应用[J].中国农业科学，2008，41（1）：9-14.

[23]Zhou B,Qu S,Liu G,et al.The eight amino-acid differences within three leucine-rice repeats between Pi2 and Piz-t resistance proteins determine the resistance specificity to Magnaporthe grisea[J].Mol Plant Microbe Interact,2006,19（11）:1216-1228.

[24]殷得所，夏明元，李进波，等.抗稻瘟病基因Pi9的STS连锁标记开发及在分子标记辅助育种中的应用 [J].中国水稻科学，2011，25（1）：25-30.

[25]Qu S,Liu G,Zhou B,et al.The broad-spectrum blast resistance gene Pi9 encodes a nucleotide-binding site-leucine repeat protein and is a member of a multigene family in rice[J].Genetics,2006,172（3）: 1 901-1 914.

[26]王惠梅，陈洁，施勇烽，等.稻瘟病抗性基因Pi25特异性CAPS标记的开发与验证[J].作物学报，2012，38（11）：1 960-1 968.

[27]朱玉君，庄杰云，樊叶杨，等.检测抗稻瘟病等位基因的特异性PCR分子标记[P]：中国，ZL200910155609.5.2012年10月3日.

[28]Wang Z,Jia Y,Rutger J N,et al.Rapid survey for presence of a blast resistance gene Pita in rice cultivars using the dominant DNA markers derived from portions of the Pita gene[J].Plant Breeding,2007, 126:36-42.

[29]Zheng K L,Huang N,Bennett,et al.PCR-based marker-assisted selection in rice breeding[J].IRRI discussion paper series NO.12.Philippines:International Rice Research Institute,1995:24.

[30]施勇烽，应杰政，王磊，等.鉴定水稻品种的微卫星标记筛选[J].中国水稻科学，2005，19（3）：195-201.

[31]Sun X,Yang Z,Wang S,et al.Identification of a 47-kb DNA fragment containing Xa4,a locus for bacterial blight resistance in rice [J].Theor Appl Genet,2003,106（4）:683-687.

[32]陈志伟，官华忠，吴为人，等.稻瘟病抗性基因Pi-1连锁SSR标记的筛选和应用 [J].福建农林大学学报：自然科学版，2005，34 （1）：74-77.

[33]朱玉君，樊叶杨，王惠梅，等.应用分子标记辅助选择培育兼抗稻瘟病和白叶枯病的水稻恢复系 [J].分子植物育种，2014，12（1）：17-24.

[34]Busto G A,Ogawa Jr T,Endo N,et al.Distribution of genes for resistance to bacterial blight of rice in Asian countries[J].Rice Genet Newslett,1990,7:127.

[35]彭绍袭，黄费元，孙国昌，等.水稻品种在不同纬度下持久抗瘟性的研究[J].中国农业科学，1996，9（2）：52-56.

Genotyping of 103 Parents of Hybrid Rice Using DNA Markers for Bacterial Blight and Blast Resistance Genes

WANG Zhen,FAN Yeyang,ZHUANG Jieyun,ZHU Yujun*
（Chinese National Center for Rice Improvement/State Key Laboratory of Rice Biology,China National Rice Research Institute,Hangzhou 310006,China;*Corresponding author:yjzhu2013@163.com）

The rice blast and bacterial blight are two of the most serious disease in rice production.The use of resistance genes in rice breeding has been known to be an efficient approach for rice protection,which requires an understanding the allelic distribution of the resistance genes in rice germplasm.The objective of this study is to determine the allelic variation of 13 resistance genes in 103 parental lines of hybrid rice，including 8 genes for bacterial blight resistance（Xa1,Xa4,xa5,Xa7,xa13,Xa21,Xa23 and Xa26）and 5 ones for blast resistance（Pib,Pi2,Pi9,Pi25 and Pita）.29 DNA markers determining the 13 genes were used for genotyping.The information could be useful in the processing of variety improvement.

Oryza sativa L;bacterial blight;rice blast;resistance gene;DNA marker

S511；S435.111.4+2；S435.111.4+7

A

1006-8082（2016）06-0020-05

2016－09－18

国家“863”计划（2014AA10A603）；中央级公益性科研院所基本业务费专项（2014RG003-1）