枯草芽孢杆菌B2的生长及其对仿刺参的益生特性

张德强，关晓燕

( 1.大连海洋学校，辽宁 大连 116023； 2.辽宁省海洋水产科学研究院，辽宁 大连 116023 )

枯草芽孢杆菌B2的生长及其对仿刺参的益生特性

张德强1，关晓燕2

( 1.大连海洋学校，辽宁 大连 116023； 2.辽宁省海洋水产科学研究院，辽宁 大连 116023 )

从大连湾地区健康的仿刺参养殖池塘沉积物中分离得到一株芽孢杆菌菌株B2，经16S rDNA鉴定以及形态学分析确定其为枯草芽孢杆菌。该菌株生长适宜温度为15～35 ℃，适宜pH为6～8，适宜盐度为30～50。电镜观察发现，枯草芽孢杆菌B2周围有明显可见的芽孢。枯草芽孢杆菌B2可产淀粉酶和蛋白酶，但不具有产脂肪酶的能力。将枯草芽孢杆菌B2按照仿刺参体质量的0.1%、0.2%和0.3%配成不同密度的菌液，添加至饲料中，投喂7 d后发现，该菌株可有效提高仿刺参肠道内的消化酶以及体腔液中多种非特异性免疫酶的活性。结果表明，枯草芽孢杆菌B2可作为益生菌剂的基础菌株添加至仿刺参饲料中。

枯草芽孢杆菌；仿刺参；消化酶；非特异性免疫酶

益生菌又称益生元或益菌素，是一种活的微生物添加剂，通过维持肠道内微生态平衡而有效影响宿主动物[1]。益生菌无毒副作用，无残留，安全性好，现今常作为一种较好的生长促进剂，添加至动物饲料中，为养殖动物带来有益的影响，如促进生长、防治疾病等[2-3]。目前应用于水产业中的益生菌主要有酵母菌、芽孢杆菌(Bacillus)、乳酸杆菌(Lactobacillus)及光合细菌等，其中芽孢杆菌属中的一些菌种抗逆性强、易储存等，日渐引起广泛的关注。

枯草芽孢杆菌(B.subtilis)是芽孢杆菌属中重要的一类，是我国农业部规定的可直接使用的益生菌剂之一，具有广谱的抗菌活性和极强的抗逆性。沈文英等[4]将枯草芽孢杆菌表达的病毒囊膜蛋白VP28添加至饲料中投喂凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)，显著提高了对虾肝胰脏中的免疫因子和非特异性免疫力，增强其对白斑综合症病毒的抗性。Aly等[5]将1×107cfu/g的枯草芽孢杆菌添加至尼罗罗非鱼(Oreochriomisniloticus)饲料中投喂1～2个月后，鱼体质量增加均高于对照组。可见，枯草芽孢杆菌可应用于水产养殖中防治疾病，增强水产动物的免疫力。然而，目前关于该菌在仿刺参养殖中的应用报道较少，亟待深入研究。笔者从大连湾地区健康仿刺参(Apostichopusjaponicus)养殖池塘底泥中分离并鉴定了一株枯草芽孢杆菌B2，研究了其生长特性及对仿刺参消化酶和非特异性免疫酶活性的影响，探讨了枯草芽孢杆菌B2在仿刺参养殖过程中的益生作用，为枯草芽孢杆菌的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种：分离自大连湾地区健康仿刺参养殖池塘沉积物。

1.1.2 培养基

(1)2216E固体及液体培养基：购自于青岛海博生物科技有限公司。

(2)淀粉琼脂培养基：蛋白胨10 mg/L，NaCl 10 mg/L，酵母粉5 mg/L，淀粉5 mg/L，琼脂15 mg/L，1000 mL蒸馏水，于121 ℃灭菌20 min后，均匀倒入平板中备用。

(3)脱脂牛奶培养基：蛋白胨10 mg/L，NaCl 10 mg/L，酵母粉5 mg/L，脱脂奶粉 5 mg/L，琼脂15 mg/L，1000 mL蒸馏水，于121 ℃灭菌20 min后，均匀倒入平板中备用。

(4)罗丹明B橄榄油琼脂培养基：蛋白胨10 mg/L，NaCl 10 mg/L, 酵母粉5 mg/L，琼脂15 mg/L，1000 mL蒸馏水，121 ℃灭菌20 min后，向培养基中加入10 mL罗丹明B溶液(1 mg/mL) 和31.25 mL橄榄油，经磁力搅拌器剧烈搅拌后，静置几分钟倒板。

1.1.3 仪器

高速冷冻台式离心机，恒温培养箱，恒温培养摇床，分光光度计，酶标仪，荧光显微镜，PCR仪，电泳仪，生物电泳图像分析系统。

1.2 方法

1.2.1 菌株的形态学观察及生长特性分析

挑取分离得到的B2菌株于平板上划线，27 ℃恒温培养24 h后，置于扫描电镜下观察菌落形态特征。

1.2.2 菌株的16S rDNA鉴定

以菌株的DNA为模板进行PCR扩增，以通用引物27F和1492R为反应引物。采用25 μL反应体系：2.5 μL 10×PCR Buffer，2 μL dNTPs，2 μL MgCl2(25 mmol/L)，上、下游引物 (10 mmol/L)各1 μL，1.25 U Taq 酶，2 μL DNA 模板，14.5 μL ddH2O。反应程序为：94 ℃，预变性4 min；94 ℃，变性30 s，56 ℃，退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30个循环；最后 72 ℃再延伸10 min。反应产物用1%的琼脂糖凝胶检测后，送至上海生工生物科技有限公司测序。利用Blastn程序与GeneBank数据库中的DNA序列进行同源性比对。

1.2.3 温度、pH、盐度对菌株生长的影响

将菌株B2进一步活化后，按照5%的接种量转接至100 mL的2216E液体培养基中，于不同的温度、盐度和pH条件下震荡培养，测定菌液在660 nm处的吸光值，分析菌株B2的生长特性。其中温度设定为15、20、25、30 ℃和35 ℃；盐度设定为30、50、75、100和125；pH设定为6、6.5、7、8、9。用NaOH溶液(1 mol/L)和HCl溶液(1 mol/L)调节2216E液体培养基的pH。

1.2.4 菌株的产酶特性分析

挑取菌株B2接种于淀粉琼脂培养基上，27 ℃恒温环境培养48 h后，向培养基中加入卢革氏碘液，根据菌株周围是否变色，判断菌株能否产淀粉酶，试验重复3次。

挑取菌株B2接种于脱脂牛奶琼脂培养基上，27 ℃恒温环境培养48 h后，根据菌落周围是否出现透明水圈，判断菌株能否产蛋白酶，试验重复3次。

挑取菌株B2接种于罗丹明B橄榄油琼脂培养基上，27 ℃恒温环境培养48 h后，在紫外线照射下观察菌落周围是否出现橙色荧光圈，判断菌株能否产脂肪酶，试验重复3次。

1.2.5 菌株对仿刺参体腔非特异性免疫酶和肠道消化酶的影响

试验用仿刺参源自大连湾健康的仿刺参养殖池塘。选取规格[体质量(12±0.19) g]相近、生长状况相似的健康仿刺参40头，在实验室暂养7 d后，饲养于装有5 L水的水箱中，每箱5头。试验组：将菌株B2配成干质量为0.06 g、0.12 g和0.18 g的3种含量的菌液，即分别为仿刺参体质量的0.1%、0.2%和0.3%，添加至仿刺参饲料中并投喂，对照组投喂不添加菌株B2的饲料。投喂7 d后，自试验组和对照组中随机取出5头刺参，充分消毒后，解剖并取其体腔液上清液和肠道，立即置于冰箱中-80 ℃冷冻保藏待测。试验采用仿刺参配合饵料，主要成分为海泥、海藻粉及鱼粉等。

采用南京建成生物工程研究所试剂盒检测仿刺参体腔液中酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、总超氧化物歧化酶，以及淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶的活性。酚氧化酶采用多巴络合物生成法检测[6]。

2 结 果

2.1 菌株B2的鉴定及生长特性

菌株B2的菌落白色，为圆形且隆起，菌落表面光滑；扫描电镜下，菌株B2呈短杆状，且周围有明显可见芽孢(图1)。将菌株B2的16S rDNA序列通过 Blastn软件与 GenBank 核酸数据库中的序列进行同源性比较，结果表明，菌株B2与枯草芽孢杆菌菌株C6-1的同源性高达99%。结合形态特征分析，初步鉴定菌株B2为枯草芽孢杆菌。

图1 菌落B2的形态特征a. 平板上菌落形态；b. 扫描电镜下菌落形态.

枯草芽孢杆菌B2的生长随温度、盐度、pH变化见图2。由图2a可见，枯草芽孢杆菌B2生长的温度范围较宽，15～35 ℃均可生长，在15 ℃下，稳定期的生长量明显低于20～35 ℃，其最适生长温度为20～35 ℃；图2b表明，枯草芽孢杆菌B2在pH为6.0～8.0时生长较快，在pH为9时生长缓慢且延滞期延长，24 h才进入生长指数期，其最适生长pH为6.0～8.0。由图2c可发现，当盐度为30～50时，枯草芽孢杆菌B2生长较好，12 h内达到稳定生长期，其最适生长盐度为30～50。

图2 枯草芽孢杆菌B2在不同温度、pH和盐度下的生长

2.2 枯草芽孢杆菌B2的产酶特性

枯草芽孢杆菌B2在脱脂奶粉培养基中可产生透明水圈，说明枯草芽孢杆菌B2可产生蛋白酶(图3a)；在培养枯草芽孢杆菌B2的淀粉培养基上滴加碘液后，菌株周围区域变为蓝色(图3b)，说明枯草芽孢杆菌B2可产生淀粉酶。枯草芽孢杆菌B2在罗丹明B橄榄油琼脂培养基中未产生橙色水圈，初步判断枯草芽孢杆菌B2不产脂肪酶。

图3 枯草芽孢杆菌B2的产酶特性a.枯草芽孢杆菌B2产蛋白酶结果；b. 枯草芽孢杆菌B2产淀粉酶结果.

2.3 枯草芽孢杆菌B2对仿刺参肠道消化酶活性的影响

枯草芽孢杆菌B2对仿刺参肠道中的淀粉酶和脂肪酶活性具有一定的刺激作用(图4)。当枯草芽孢杆菌B2的添加量为仿刺参体质量的0.2%时，试验组仿刺参肠道淀粉酶和蛋白酶活性显著高于对照组(P<0.05)；而当添加量为0.3%时，枯草芽孢杆菌B2对仿刺参体内两种酶的刺激效果下降，但仍然高于对照组。在3种添加剂量下，枯草芽孢杆菌B2对仿刺参体内脂肪酶无明显的刺激作用(图4c)，处理样品中该酶的活性略高于对照组。由此可见，枯草芽孢杆菌B2对仿刺参肠道消化酶的影响与其自身产酶特性基本一致，适量投喂可有效提高仿刺参体内消化酶的活性。

图4 枯草芽孢杆菌B2对仿刺参体内消化酶活性的影响

2.4 枯草芽孢杆菌B2对仿刺参非特异性免疫酶活性的影响

枯草芽孢杆菌B2明显刺激仿刺参体腔液中酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、总超氧化物歧化酶和酚氧化酶的活性(图5)。与对照组相比，添加0.1%和0.2%的枯草芽孢杆菌B2后，试验组仿刺参体腔液酸性磷酸酶活性与对照组相比无显著差异(P>0.05)，而碱性磷酸酶、总超氧化物歧化酶和酚氧化酶活性却显著高于对照组(P<0.05)。添加0.3%的枯草芽孢杆菌B2后，可有效提高仿刺参体内酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和酚氧化酶的活性，然而对于总超氧化物歧化酶活性的影响却随着添加量的增加而下降，但仍显著高于对照组(P<0.05)。由此可见，适量投喂枯草芽孢杆菌B2可提高仿刺参体内非特异性免疫酶的活性。

图5 枯草芽孢杆菌B2对仿刺参体内免疫酶活性的影响

3 讨 论

枯草芽孢杆菌是一种在养殖水体中普遍存在的益生菌，适应性强，能在动物肠道中稳定定殖，还具有净化水质，分泌消化酶促进消化，提高动物机体免疫力等益生作用[7-8]。从大连湾地区的健康养殖池塘中分离得到的枯草芽孢杆菌B2可在15～35 ℃生长，适宜pH为6.0～8.0，适宜盐度为30～50，具有芽孢杆菌的一般特征，电镜观察菌株周围见明显芽孢，具有一定的抗逆性，可以作为仿刺参养殖中的益生菌。

枯草芽孢杆菌在生长过程中会产生许多活性物质和大量的胞外酶，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等[9]。这些活性酶能有效将饲料残饵中的淀粉、蛋白质和脂肪等物质分解，提高饲料中营养成分的消化利用率，促进动物的生长[10-11]。本研究中的枯草芽孢杆菌B2可分泌淀粉酶和蛋白酶，未检测到脂肪酶。

枯草芽孢杆菌产生的胞外酶可有效刺激动物体内多种消化酶的活性，补充内源酶的不足。本研究给仿刺参投喂适量的枯草芽孢杆菌B2后，可有效提高其肠道内的蛋白酶和淀粉酶活性，但对肠道脂肪酶的活性影响不显著，这与董春光等[12]的结果相似。结合枯草芽孢杆菌B2的产酶情况初步推测，其分泌的消化酶种类对仿刺参肠道消化酶活性的影响具有一定的选择性。沈斌乾等[13]研究表明，当青鱼(Mylopharyngodonpiceus)摄食添加枯草芽孢杆菌的饲料后，肠淀粉酶活性显著高于对照组，且随着添加量的增大而不断上升。刘晓勇等[14]在杂交鲟(Acipenserbaeri♂×A.schrenkii♀)幼鱼的日粮中添加了不同质量分数的枯草芽孢杆菌，当添加量为0.25%时，投喂15 d后，除可有效提高鱼体肠道内蛋白酶、淀粉酶和消化酶的活性外，还可正向刺激一些免疫酶如碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶，以上均与本试验结果一致。

仿刺参体腔细胞分泌的非特异性免疫酶活性的高低直接影响仿刺参对病原菌及有害物质的抵抗力[15]。研究表明，在养殖水体或饲料中添加枯草芽孢杆菌可以刺激水产动物的非特异性免疫酶活性[14]。本研究用适量的枯草芽孢杆菌B2投喂仿刺参后，有效提高了仿刺参体腔液中的酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶和酚氧化酶的活性，尤其是酸性磷酸酶。综上所述，枯草芽孢杆菌B2作为一种常用的益生菌剂，可以产生正向的免疫功能刺激作用，可作为仿刺参的饲料添加剂。

[1] Fuller R. A review:probiotics in man and animals[J]. Appl Bacteriol, 1989, 66(5)：365-378.

[2] 刘磊，金梅，许波，等. 全价饲料中添加有益光合细菌在仔猪生产中的应用[J]. 中国农学通报, 2011, 27(20)：45-50.

[3] 赵治平，黄克和，任志华，等. 富硒锌益生菌对犬的全血硒锌含量与抗氧化能力和肠道菌群的影响[J]. 营养学报, 2009, 31(2)：159-163.

[4] 沈文英, 傅玲琳, 李卫芬. 枯草芽孢杆菌表达的 VP28 对南美白对虾免疫力和抗病毒感染的影响[J]. 水生生物学报, 2012,36(2)：375-378.

[5] Aly S M, Ahmed Y A G, Aharrrb A A A, et al. Studies onBacillussubtilisandLactobacillusacidophilus, as potential probiotics, on immune response and resistance of tilapia nilotica (Oreochromisnilotics) to challenge infections [J]. Fish & Shellfish Immunology, 2008, 25 (1/2)：128-136.

[6] Hernández-López J, Gollas-Galván T, Vargas-Albores F. Activation of the prophenoloxidase system of the brown shrimpPenaeuscaliforniensisHolmes[J]. Pharmacology, Toxicology and Endocrinology, 1996, 113(1):61-66.

[7] 李桂英, 孙艳, 宋晓玲, 等. 饲料中添加潜在益生菌对凡纳滨对虾肠道消化酶活性和菌群组成的影响[J]. 渔业科学进展, 2013, 34(4)：84-90.

[8] 丁贤, 李卓佳, 陈永青, 等. 芽孢杆菌对凡纳对虾生长和消化酶活性的影响[J]. 中国水产科学, 2004, 11(6)：580-584.

[9] David J, Gary N, Owens K, et al. Formation of volatile compounds during fermentation of soya beans byBacillussubilis[J]. Journal of the Science of Food Agriculture, 1997, 74(1)：132-140.

[10] 王振华. 高产酶枯草芽孢杆菌制剂在奶牛生产上的应用研究[J].安徽农业科学，2008,36(27)：11771-11773.

[11] 和小黑，张文举，魏晓燕. 枯草芽孢杆菌产酶活性改良研究进展[J]. 中国饲料, 2014(15)：8-16.

[12] 董春光，杨爱国，孙秀俊,等. 枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)在刺参养殖中的益生作用[J].渔业科学进展, 2015, 36(3)：109-115.

[13] 沈斌乾, 陈建明, 郭建林, 等. 饲料中添加枯草芽孢杆菌对青鱼生长、消化酶活性和鱼体组成的影响[J]. 水生生物学报, 2013, 37(1)：48-53.

[14] 刘晓勇, 张颖, 齐茜,等. 枯草芽孢杆菌对杂交鲟幼鱼生长性能、消化酶活性及非特异性免疫的影响[J]. 中国水产科学, 2011, 18(6)：1315-1320.

[15] Eliseikina M G, Magarlamov T Y. Coelomocyte morphology in the holothuriansApostichopusjaponicus(Aspidochirota：Stichopodidae) andCucumariajaponica(Dendrochirota：Cucumariidae)[J]. Rus J Mar Biol, 2002, 28(3)：197-202.

GrowthandProbioticCharacteristicsofBacillussubtilisB2inSeaCucumberApostichopusjaponicus

ZHANG Deqiang1, GUAN Xiaoyan2

( 1.Dalian Ocean School, Dalian 116023, China；2.Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute, Dalian 116023, China )

A bacterial strain B2 isolated from sediment in healthy sea cucumberApostichopusjaponicusfarm in Dalian was identified asBacillussubtilisby morphological and 16S rDNA sequence analysis. It was found that the optimal growth of strain B2 was observed at temperature of 15—35 ℃, pH of 6—8 and a salinity of 30—50. The electron microscopy revealed that there was visible gemma around strain B2 obviously. The strain B2 produced both amylase and protease, but did not secreate lipase. The different doses of the strain B2 was added into the diets according to the weight of sea cucumber by 0.1%, 0.2% and 0.3%, and it was found that the strain B2 effectively improved the activities of digestive enzymes in the intestine and nonspecific immune enzymes in the coelomic fluids. The findings indicate thatB.subtilisB2 can be used as basis strain of probiotics and added into the sea cucumber feed, which can provide more resources for the further sea cucumber probiotics.

Bacillussubtilis; sea cucumber; digestive enzyme; nonspecific immune enzyme

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.03.007

S917

A

1003-1111(2016)03-0234-05

2015-11-08；

2016-01-26.

国家海洋局海洋公益项目(201305001)；辽宁省科技计划项目(2015103044)；辽宁省渔业科技项目(201301).

张德强(1957-)，男，高级实验师；研究方向：海洋渔业职业教育.E-mail：ZDQ761@126.com. 通讯作者：关晓燕(1983-)，女，助理研究员；研究方向：海洋微生物.E-mail:guanxiaoyan201@163.com.