马尾藻属新变种——拟披针叶马尾藻潭门变种的形态鉴定及系统进化分析

邹潇潇，刘鑫鑫，朱 军，林 勇，黄惠琴，鲍时翔

( 中国热带农业科学院 热带生物技术研究所，海南 海口 571101 )

马尾藻属新变种
——拟披针叶马尾藻潭门变种的形态鉴定及系统进化分析

邹潇潇，刘鑫鑫，朱 军，林 勇，黄惠琴，鲍时翔

( 中国热带农业科学院 热带生物技术研究所，海南 海口 571101 )

在海南省琼海市潭门镇发现了一种未见报道的马尾藻。形态鉴定结果显示，该马尾藻与拟披针叶马尾藻的形态特征十分相似，但气囊结构有明显差异，故将其定名为拟披针叶马尾藻潭门变种。对该新变种的内转录间隔区序列特征及其与马尾藻属其他物种的亲缘关系进行了分析，结果显示，拟披针叶马尾藻潭门变种隶属于真马尾藻亚属，并与瓦氏马尾藻和亨氏马尾藻具有较近的亲缘关系。

新变种；褐藻；马尾藻；形态鉴定；系统进化分析

马尾藻(Sargassum)是褐藻门、马尾藻科、马尾藻属的一类重要经济海藻。马尾藻褐藻淀粉含量很高，是提取褐藻胶的重要工业原料[1]；马尾藻还含有多种维生素和矿物质元素，作为饲料添加剂喂养家禽、牲畜，既可提高饲料的利用效率，又能提高饲养动物的免疫力[2]；马尾藻的多种营养成分，如从其藻体中提取的多糖，具有增强机体免疫力、抑制癌细胞、抗菌抗病毒等生理活性，保健和药用价值极高[3-6]，因此马尾藻在工业、农业、食品及医药等方面都有着十分广阔的开发与应用前景。此外，马尾藻还可有效吸收氮、磷等导致水体富营养化的有机元素以及海水中的重金属离子，对改善水体环境和海洋生态修复具有重要意义[7-8]。近年来随着人们对海洋环境修复的重视度增加，马尾藻的生态应用价值更加凸显。

马尾藻多数为暖水性海藻，广泛分布于暖水和温水海域的近岸低潮带和潮下带[9-10]。马尾藻属种类甚多, 目前有记录的种、变种及变型达941个，其中已被证实的仅有353种[11]。我国已报道的马尾藻有131种，主要分布于南海、黄海和东海；其中南海的热带马尾藻资源繁多，共约124种，并且半数以上为我国所特有的种类[12-14]。

海南岛位于热带北边缘，其海域广阔、气候适宜，非常适于马尾藻的生长，使得海南省的马尾藻资源非常丰富，为沿海居民带来了巨大的经济利益。但由于目前马尾藻的利用以采摘野生资源为主，对海南省马尾藻资源的分布规律和多样性研究很少。此外，随着部分海域环境的不断恶化，海南马尾藻资源面临着一定程度的威胁，资源保护成为一个刻不容缓的任务。因此，开展海南的马尾藻资源的调查和分类研究，对深入了解和保护其物种多样性，加快相关资源的开发和利用进程具有重要的现实意义。本研究在海南省琼海市潭门镇发现了一个与已报道马尾藻形态特征有差异的新变种，并对其ITS序列特征及与其他马尾藻的亲缘关系进行分析。研究结果不仅能丰富对海南马尾藻物种多样性的认识，而且也可为马尾藻资源的开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集及处理

马尾藻样品BTM038采自海南省琼海市潭门镇海域，采集成熟的完整藻体，用灭菌海水反复冲洗，除去附着的泥沙、多毛类、甲壳类动物及其他杂藻。将洗净的马尾藻分成两份：一部分藻体完整的藻株于玻璃缸中暂养，以便后续的形态学鉴定；另一部分则选取适量新鲜幼嫩的藻叶，用吸水纸吸干表面水分后，-80 ℃超低温冰箱保存。

1.2 形态学鉴定

以曾呈奎[9]制定的马尾藻形态学分类原则为主要依据，对马尾藻BTM038的主干、初生分枝和次生分枝的直径、初生叶、次生叶的形状和大小、气囊、固着器和生殖托的形态以及是否具有毛窝等特征进行分类鉴定。

1.3 ITS序列分析

1.3.1 基因组DNA提取

将马尾藻藻体清洗干净后，取约1.0 g马尾藻叶片，用液氮研磨成粉状后，采用改良的 CTAB 法提取基因组DNA[15]。

1.3.2 PCR扩增与序列测定

将提取的马尾藻基因组DNA质量浓度调整到50 ng/μL后，作为PCR反应的模板，参照Yoon等[16]的方法对其内转录间隔区(ITS)序列进行扩增，引物序列为：LB1(F):5′-CGCGAGTCATCAGCTCGCATT-3′；LB2(R): 5′-AGCTTCACTCGCCGTACTGG-3′,PCR扩增程序为：94 ℃ 6 min；94 ℃ 1 min，62 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，36 个循环；72 ℃ 10 min。PCR反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(生工生物工程上海股份有限公司)对其进行回收，然后与pMD18-T载体(大连宝生物有限公司)在4 ℃条件下进行连接反应。连接产物转化至大肠肝菌(Escherichiacoli)(DH5α)感受态细胞后，随机挑选3个阳性克隆，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.3.3 数据分析

利用DNAman软件对测序所得序列进行拼接和校正，获得马尾藻样品BTM038的ITS一致序列。将一致序列提交至GenBank数据库进行BLAST比对，并下载马尾藻属19个物种的ITS序列，利用Mega 6.0 软件进行多序列比对；以囊链藻(Myagropsismyagroides)的序列(AY150022.1)作为外群，采用邻接法、最大似然法、最大简约法等方法分别构建系统进化树，Bootstrap设为1000次重复。

2 结果与分析

2.1 马尾藻BTM038的形态学特征

马尾藻BTM038形态描述和图片分别见表1、图1。

表1 马尾藻BTM038主要部位的形态描述

图1拟披针叶马尾藻潭门变种主要部位的形态

a.藻体； b，c.藻叶；d.气囊； e.生殖托.

2.2 马尾藻BTM038与拟披针叶马尾藻形态特征的比较

马尾藻BTM038与文献记录中的拟披针叶马尾藻(S.pseudolanceolatum)[9]具有很多相似的特征： ①初生分枝圆柱形，光滑；②藻叶披针形；③气囊球形或卵圆形；④雌雄异株；⑤雌生殖托扁压，扁平，顶部较宽，小刺集中于此，雄生殖托圆柱形，上部具几个刺等。

但两者在气囊的形态结构上有明显不同(图2)。马尾藻BTM038的气囊主要特征为：呈卵圆形，边缘有细边包裹，顶部带有与气囊直径长度相近的尖；囊柄叶状，毛窝两列，边缘有锯齿，比气囊的长度略长。拟披针叶马尾藻的气囊形态为：成熟时球形，幼期卵圆形，顶端圆形，表面具有几个毛窝，囊柄较短，圆柱形，表面光滑，气囊顶部不具备与气囊直径长度相近的尖。由于马尾藻BTM038与拟披针叶马尾藻相比，只在气囊的形态结构上具有明显不同,而两者其他部位的形态结构非常相似，因此将马尾藻BTM038暂时定名为拟披针叶马尾藻潭门变种(S.pseudolanceolatumvar.tanmen)。

图2 拟披针叶马尾藻潭门变种与拟披针叶马尾藻的气囊结构比较a. 拟披针叶马尾藻的气囊[9]；b. 拟披针叶马尾藻潭门变种的气囊.

2.3 ITS序列特征

经PCR扩增和序列拼接和校正，得到马尾藻BTM038的ITS序列全长(GenBank登录号：KP101265)，经过与GenBank中发布的其他马尾藻物种的ITS序列进行比对后，确定ITS1和ITS2的序列范围。结果表明，马尾藻BTM038的ITS序列全长为1440 bp，其中ITS1的序列长度为856 bp，5.8S序列长度为150 bp，ITS2序列长度为434 bp。ITS1和ITS2的GC含量分别为59.3%和59.2%。

2.4 系统进化分析

从GenBank下载马尾藻属19个物种的ITS序列，利用Mega 6.0 软件将马尾藻BTM038的ITS序列与这些参考序列进行比对，并以囊链藻(M.myagroides)的ITS序列(AY150022)作为外群，分别采用邻接法、最大似然法和最大简约法等构建系统进化树。由于3种方法得到的聚类的结果基本一致，故仅展现最大似然法得到的系统进化树(图2)。系统进化分析显示，马尾藻属物种的被分为2个大的分支：其中真马尾藻亚属(S．subgen．Sargassum)的物种聚为一支，反曲叶亚属(S．subgen．Bactrophycus)的7个物种聚为另一支，且2个分支均具有较高的支持率。马尾藻BTM038与瓦氏马尾藻(S.vachellianum)和亨氏马尾藻(S.henslowianum)位于真马尾藻亚属内的一个独立小分支，且具有很高的支持率，说明马尾藻BTM038与这两种马尾藻具有更近的亲缘关系，而与其他真马尾藻亚属物种具有明显差异。

图3 利用ITS序列对拟披针叶马尾藻潭门变种的系统进化分析

3 讨 论

3.1 马尾藻属的分类鉴定

马尾藻属是褐藻门中最为复杂的属之一，该属物种的分类鉴定至今已有190多年历史。马尾藻的分类主要基于形态特征进行，自1820年瑞典学者C. Agardh 首次创立马尾藻属以来，已有大约1000多种马尾藻被报道(包括同物异名)。但是由于马尾藻形态可塑性较大，并且可随时间、环境等因素的改变而变化，甚至有些种类在个体之间也有很大差异，进一步增加了该属物种分类鉴定工作的难度[17]。我国的马尾藻资源虽然非常丰富，但是对南海热带马尾藻的研究甚少，对其种类多样性、生物学特性等方面的认识都十分有限，导致优良热带马尾藻资源的养殖和利用一直处于落后状态。因此，开展对海南的马尾藻资源的调查和分类研究，对加快相关资源的开发和利用具有重要意义。

拟披针叶马尾藻是曾呈奎等[9]于2000年在海南三亚市榆林大东海发现的一种我国特有马尾藻种类。本研究在开展对海南马尾藻资源调查与分类研究的过程中，在潭门镇发现了一种未见报道的马尾藻，虽然其形态特征与拟披针叶马尾藻非常相似，但两者的气囊形态结构存在明显不同，因而将该变(新)种暂时定名为拟披针叶马尾藻潭门变种。

3.2 BTM038与其他马尾藻物种的亲缘关系

为进一步研究拟披针叶马尾藻潭门变种与其他马尾藻之间的亲缘关系，本研究对BTM038的ITS序列进行了分析，借助目前已有的马尾藻物种ITS序列信息，发现BTM038与真马尾藻亚属的瓦氏马尾藻和亨氏马尾藻的亲缘关系较近，而与其他真马尾藻亚属的物种明显不同。瓦氏马尾藻是一种在我国分布范围较广的特有种类[18-19]，而亨氏马尾藻是藻体大小变化较大的一个种[20]；在形态上，这两种藻类具有一定的相似性，尤其是在营养体阶段，两者的藻叶和一般习性极易混淆[9]。本研究的系统进化分析结果显示瓦氏马尾藻和亨氏马尾藻首先聚在一起，也暗示了这两者之间可能存在较近的亲缘关系。由于目前数据库中提供的马尾藻物种序列信息非常有限，虽然BTM038在系统进化树上与这两种马尾藻聚在一个小分支内，但是在形态上与这两者存在一定差异；然而数据库中缺乏与其形态特征非常相似的拟披针叶马尾藻的序列信息，目前尚无法确认这两者之间是否具有较近的亲缘关系。因此，若要准确判断拟披针叶马尾藻潭门变种的分类地位，还需进行大量的马尾藻资源调查研究及相关物种基因信息的采集与分析。

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MorphologicalIdentificationandPhylogeneticAnalysisofBrownSeaweedSargassumpseudolanceolatumvar.tanmen,aNewVarietyinSargassumGenus

ZOU Xiaoxiao, LIU Xinxin, ZHU Jun，LIN Yong，HUANG Huiqin, BAO Shixiang

( Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Science, Haikou 571101, China )

A previously unreportedSargassumspecies was identified in Tanmen, Qionghai city of Hainan province. Morphological identification revealed that most features of the unreportedSargassumspecies were very similar toS.pseudolanceolatum, except for the structures of vesicles, thus, it was namedS.pseudolanceolatumvar.tanmen. Further analysis of the sequence characteristics of internal transcribed space, and the genetic relationship betweenS.pseudolanceolatumvar.tanmenand otherSargassumspecies showed thatS.pseudolanceolatumvar.tanmenbelonged toS．subgen．Sargassum, and was closely related toS.vachellianumandS.henslowianum.

new variety; brown alga;Sargassum; morphological identification; phylogenetic analysis

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.06.013

S932.7

A

1003-1111(2016)06-0681-05

2016-03-01；

2016-04-29.

海洋公益性行业科研专项(2014050402)；海洋经济创新发展区域示范项目(12PYY001SF08)；海南省科技兴海专项(XH201408)；海南省自然科学基金资助项目(20163119)；院本级基本科研业务费专项资金资助项目(ITBB2015RC07，1630052015038).

邹潇潇(1983—)，女，助理研究员，博士；研究方向：藻类生物学.E-mail：zouxiaoxiao@itbb.org.cn.通讯作者：鲍时翔(1966—)男，研究员，博士；研究方向：藻类生物学.E-mail：baoshixiang@itbb.org.cn.