多子小瓜虫滋养体糖蛋白残基的种类和分布研究

赖晓健，熊 静，张 哲，李忠琴

( 1. 集美大学 水产学院，福建 厦门 361021； 2. 鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心，福建 厦门 361021； 3. 福建省水产研究所，福建 厦门 361000 )

多子小瓜虫滋养体糖蛋白残基的种类和分布研究

赖晓健1,2，熊 静1,2，张 哲3，李忠琴1,2

( 1. 集美大学 水产学院，福建 厦门 361021； 2. 鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心，福建 厦门 361021； 3. 福建省水产研究所，福建 厦门 361000 )

应用伴刀豆凝集素A、麦胚凝集素、大豆凝集素和荆豆凝集素Ⅰ，检测寄生于金鱼皮肤、鳃和鳍上的多子小瓜虫滋养体糖蛋白残基的种类和分布。研究结果发现，伴刀豆凝集素A和麦胚凝集素免疫阳性染色在金鱼皮肤、鳃和鳍寄生的滋养体上均有分布，麦胚凝集素免疫阳性染色强于伴刀豆凝集素A，未见有大豆凝集素和荆豆凝集素Ⅰ免疫阳性染色。鳃上寄生的滋养体伴刀豆凝集素A免疫阳性染色最强，皮肤次之，鳍最弱。鳍上寄生的滋养体麦胚凝集素免疫阳性染色最强，皮肤次之，鳃最弱。研究结果表明，滋养体有单糖D-甘露糖和D-葡萄糖，以及氨基衍生物乙酰氨基葡萄糖。寄生于鳃上的滋养体D-甘露糖和D-葡萄糖可能较多，寄生在鳍上的滋养体乙酰氨基葡萄糖可能较多。

植物凝集素；多子小瓜虫；糖基；金鱼

多子小瓜虫(Ichthyophthiriusmultifiliis)隶属原生动物门、寡膜纤毛纲、膜口目、凹口科、小瓜虫属。多子小瓜虫的生活史分为滋养体、包囊体和掠食体3个阶段。多子小瓜虫能够破坏宿主鱼呼吸、排泄和渗透机能，导致鱼体死亡[1-2]，从而减少鱼的种群数量。多子小瓜虫是一种世界性分布的淡水鱼类专性寄生虫，对宿主没有严格的选择性，大多数淡水鱼类都受其危害，该病流行面广，患病鱼死亡率很高，随着水产养殖集约化程度的不断提高、养殖密度的不断加大，该问题日益突出，已造成极大的经济损失[3]。

已有的研究表明，鱼类寄生虫的外膜含有糖蛋白残基，包括多子小瓜虫[4]。这些糖类和寄生虫的宿主识别和贴附宿主细胞有关，也能够调控入侵寄生虫的行为[5]。植物凝集素由于其特异性识别和结合糖基的基本功能，可应用于抗植物病毒、动物病毒、真菌和昆虫等[6]。外源植物凝集素能特异性识别鱼类寄生虫膜上的糖基，且由于糖结合域的保守性，植物凝集素一般只能结合一种单糖或寡聚糖[7]。有学者应用外源植物凝集素封闭寄生虫表面的糖基后，发现寄生虫对鱼类宿主细胞的黏附作用和入侵受到抑制[8-9]。本研究选用的伴刀豆凝集素A、麦胚凝集素、大豆凝集素和荆豆凝集素Ⅰ能够与大多数已发现的寄生虫糖基结合，应用这4种植物凝集素可以查明多子小瓜虫滋养体糖蛋白残基的种类和分布[10]。多子小瓜虫对宿主的识别、贴附和入侵以及宿主病理学过程中糖基和凝集素相互作用的研究可以对多子小瓜虫病害的防治提供新思路，还可为病原寄生虫抗原合成的特异阻断剂的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

感染多子小瓜虫的金鱼(Carassiusauratus)购自水族店。将病鱼投入含30 mg/L 间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐的麻醉液中。取受感染的金鱼组织皮肤、鳃和鳍，用新配的4%多聚甲醛固定8～12 h，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。连续切片6 μm，4 ℃冰箱保存备用。

1.2 试剂药品

间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐购自美国Sigma公司，生物素化植物凝集素购自美国Sigma和Vector公司。特异结合糖类和工作浓度等见表1。糖类购自Acros和阿拉丁公司，链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶和DAB试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。其他化学试剂为国药化学分析纯。

表1 试验使用的植物凝集素、来源物种、使用量、特异性结合糖类、封闭糖类及浓度

1.3 免疫组织化学试验

切片脱蜡复水后, 按常规方法进行免疫组织化学反应。滴加新鲜配制的1%H2O2，室温孵育20 min。蒸馏水浸洗，TTBS缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，pH 7.2，含0.05%Tween20)浸泡5 min。一抗采用生物素化凝集素20 ℃孵育1 h。使用生物素化凝集素前，先将生物素化凝集素和与之特异性结合的糖类在20 ℃中孵育1 h，以去除非特异性结合的干扰。TTBS浸洗3次×5 min后滴加链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶，20 ℃孵育30 min。TTBS浸洗3次×5 min。二氨基联苯胺显色3～8 min，蒸馏水冲洗,苏木精轻度复染、脱水、透明、封片。阴性对照片采用相邻组织切片，用磷酸盐缓冲液代替凝集素进行孵育，进行上述免疫组织化学反应程序。

2 结 果

2.1 多子小瓜虫的感染部位

多子小瓜虫感染的金鱼体表，皮肤和鳍均可见“白点”。揭开病鱼鳃盖，也见鳃丝上有“白点”。寄生于金鱼的多子小瓜虫滋养体直径超过600 μm，明显可见马蹄形大核。取受感染金鱼皮肤、鳃和鳍组织，进行切片观察，多子小瓜虫滋养体大核明显，食物泡中有大量的鱼体细胞。滋养体已侵入表皮层(图1c)，表皮破裂、脱落，有的已进入真皮层，接近肌肉层(图1a)，在鳃组织中多子小瓜虫侵入鳃小片之间，破坏鳃丝上皮和鳃小片上皮，两个鳃小片之间的上皮细胞几乎完全脱落，部分鳃小片残缺不全，断裂、脱落，鳃丝和鳃小片结构模糊(图1b)。

图1 感染多子小瓜虫的金鱼组织苏木精·伊红染色图a，皮肤；b，鳃；c，鳍；m，肌肉；gl，鳃小片；e，表皮.箭形所示为多子小瓜虫. 标尺：50 μm.

2.2 植物凝集素免疫阳性染色在多子小瓜虫滋养体的分布

免疫组织化学试验结果表明，阴性对照均未见免疫阳性染色(图2,a1～c1)。滋养体上有伴刀豆凝集素A和麦胚凝集素免疫阳性染色分布，伴刀豆凝集素A免疫阳性染色主要集中在滋养体的表面和细胞核周围(图2,a2～c2)，麦胚凝集素免疫阳性染色在滋养体的表面、细胞核周围和细胞质内均有分布(图2,a3～c3)，麦胚凝集素免疫阳性染色强于伴刀豆凝集素A。滋养体上均未见大豆凝集素和荆豆凝集素Ⅰ免疫阳性染色(图2, a4～c5)。

在伴刀豆凝集素A免疫组织化学染色中，鳃上寄生的多子小瓜虫滋养体免疫阳性染色最强，皮肤次之，鳍最弱；而在麦胚凝集素免疫组织化学染色中，鳍上寄生的多子小瓜虫滋养体免疫阳性染色最强，皮肤次之，鳃最弱。

图2 伴刀豆凝集素A，麦胚凝集素，大豆凝集素和荆豆凝集素I免疫染色图纵向：1，阴性对照；2，伴刀豆凝集素A免疫染色；3，麦胚凝集素免疫染色；4，大豆凝集素免疫染色；5，荆豆凝集素Ⅰ免疫染色.横向：a，皮肤；b，鳃；c，鳍.箭形所示为免疫阳性染色位点. 标尺:20 μm.

3 讨 论

本试验发现，伴刀豆凝集素A和麦胚凝集素能够与寄生在鱼体的多子小瓜虫滋养体表面结合。结果表明，滋养体表面有单糖D-甘露糖和D-葡萄糖，氨基衍生物乙酰氨基葡萄糖。Xu等[4]对多子小瓜虫掠食体与植物凝集素的结合试验表明，质量浓度为50 μg/mL的小扁豆凝集素、大豆凝集素、荆豆凝集素Ⅰ和麦胚凝集素能够与50%以上的掠食体结合。此结果提示掠食体表面有，单糖D-半乳糖、L-岩藻糖、D-甘露糖和D-葡萄糖；氨基衍生物乙酰氨基半乳糖和乙酰氨基葡萄糖。本研究发现的多子小瓜虫滋养体与Xu等[4]发现的掠食体表面糖基种类有差异，其表面不同的糖基组成可能对滋养体和掠食体完成不同的生理功能起着不同的作用。伴刀豆凝集素A和麦胚凝集素分布不同，表明不同部位滋养体表面糖基可能存在差异。寄生于鳃上的滋养体表面D-甘露糖、D-葡萄糖较多，而寄生于鳍上的滋养体表面乙酰氨基葡萄糖可能较多。不同糖基对多子小瓜虫的寄生可能起不同的作用。

已有的研究表明，很多鱼类寄生虫的外膜含有糖基，如多子小瓜虫掠食体[4]，隐鞭虫属(Cryptobia)[11]，侵袭内阿米巴(Entamoebainvadens)[12]，香鱼微孢子虫(Glugeaplecoglossi)[9]，利什曼原虫属(Leishmania)[13]和球孢虫属(Sphaerospora)[14]种类。本研究发现的多子小瓜虫滋养体膜上有与外源植物凝集素特异性结合的糖基分布的现象，亦在两种鱼类肠道寄生虫中发现。伴刀豆凝集素A能够识别黏孢子虫(Enteromyxumscophthalmi)膜上的葡萄糖—甘露糖；大豆凝集素，西非单豆叶凝集素Ⅰ，麦胚凝集素以及荆豆凝集素能够识别N-乙酰氨基葡萄糖，N-乙酰氨基半乳糖和α-D-半乳糖[15]。而伴刀豆凝集素A和荆豆凝集素Ⅰ能够分别识别金头鲷(Sparusaurata)上李氏肠黏虫(E.leei)膜上的葡萄糖—甘露糖和海藻糖[7]。

本研究还发现，除在滋养体表面，滋养体的细胞质和细胞核周围也有免疫阳性染色，表明有糖基的分布。在寄生的黏孢子虫和李氏肠黏虫虫体内的孢子中也发现有植物凝集素的免疫阳性染色[7,15]。据此推测，可能由于寄生在鱼体的滋养体体内已经合成相关的糖蛋白，为后面的包囊体生活史阶段做好准备。

体外试验已表明，多子小瓜虫掠食体对宿主血清和黏液的成分具有选择性，其中掠食体很可能首先通过打开宿主的黏液细胞而进入黏液细胞丰富的皮层[16]，而血清能够吸引掠食体对宿主的穿透行为[17]。寄生虫外膜糖蛋白的糖基很可能参与了寄生虫的宿主识别和贴附作用[5]，所以这些寄生虫的糖基对于宿主鱼类来说是重要的抗原[18]，用外源植物凝集素封闭寄生虫表面的糖基后，发现一些寄生虫对鱼类宿主细胞的黏附作用和入侵受到抑制[8-9,19]，大豆凝集素等植物凝集素能够抑制多子小瓜虫掠食体的运动和掠食体向滋养体的发育[4]。所以利用寄生虫的糖基与凝集素特异性结合的特点研制出特异性封闭寄生虫糖基或抑制其合成的药物有很大的应用前景[20]。这个想法在人类医学上已有成功实现的例子。Mahalingam等[21]人工合成了一种外源性凝集素，这种凝集素能够与人类免疫缺陷病毒包膜上的糖结合，阻止人类免疫缺陷病毒进入宿主细胞，从而阻止该病毒的感染。本研究应用外源性的植物凝集素发现了滋养体糖蛋白残基，可为人工合成能够与滋养体糖基特异性结合的外源性凝集素的研发提供理论依据。

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DetectionofCarbohydrateTerminalsinParasiteIchthyophthiriusmultifiliisTrophont

LAI Xiaojian1,2, XIONG Jing1,2, ZHANG Zhe3, LI Zhongqin1,2

( 1.College of Fisheries, Jimei University, Xiamen 361021, China; 2. Engineering Research Center of Modern Eel Technical Industry, Ministry of Education, Xiamen 361021, China; 3. Fisheries Research Institute of Fujian, Xiamen 361000, China )

In the present study, parasiteIchthyophthiriusmultifiliisinvaded into skin, gill and fin of gold fish (Crassiusauratus) was sampled, and the special binding sites of the parasitic trophont′s carbohydrate residues were pinpointed using plant lectins Con A, WGA, SBA and UEA-Ⅰ. The results showed Con A and WGA immunostainings were observed in the parasite trophonts, and Con A immunostaining was stronger than WGA. SBA and UEA-Ⅰ immunostainings were not found in the tissues. Trophonts in the gill showed stronger Con A immunostaining than those in the skin and fin. The trophonts in the fin showed stronger WGA immunostaining than those in the skin and gill. There were mannose/glucose residues and also N-acetylglucosamine residues in the trophonts. It is inferred that trophonts in the gill had more mannose/glucose residues than those in the skin and fin, and trophont in the fin had more N-acetylglucosamine residues than those in the skin and gill.

plant lectin;Ichthyophthiriusmultifiliis; carbohydrate residue;Carassiusauratus

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.06.019

S941.5

A

1003-1111(2016)06-0713-05

2015-11-09；

2016-03-11.

鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心开放基金资助项目(RE201308)；福建省自然科学基金资助项目(2013J05052)；福建省科技厅重点项目(2013Y0089)；厦门市科技局项目(3502Z20133015)；集美大学科研启动金资助项目(ZQ2012001)．

赖晓健(1984—)，男，助理研究员，博士；研究方向：水产养殖与病害防治．E-mail: laixj@jmu.edu.cn．通讯作者：熊静(1979—)，女，助理研究员，博士；研究方向：水产动物免疫与病害防治．E-mail: xiongjing@jmu.edu.cn．