响应面法优化蜡样芽孢杆菌产类细菌素培养基

徐顾榕,陈志伟,*,钟小廷,熊 华,左晓玲,张 庆

(1.西华大学食品与生物工程学院,四川省食品生物技术重点实验室,四川成都 610039; 2.四川千禾味业食品股份有限公司,四川眉山 620010)



响应面法优化蜡样芽孢杆菌产类细菌素培养基

徐顾榕1,陈志伟1,*,钟小廷2,熊 华1,左晓玲1,张 庆1

(1.西华大学食品与生物工程学院,四川省食品生物技术重点实验室,四川成都 610039; 2.四川千禾味业食品股份有限公司,四川眉山 620010)

采用响应面分析法对产类细菌素的蜡样芽孢杆菌XH25(BacilluscereusXH25)培养基进行优化,以金黄色葡萄球菌为指示菌,抑菌圈直径作为响应值。利用Plackett-Burman设计筛选出影响抑菌圈直径的显著因素:pH、可溶性淀粉和(NH4)2SO4。通过最陡爬坡实验逼近最大抑菌圈直径区域。采用中心组合设计法及响应面分析确定:pH6.15、可溶性淀粉15.32 g/L和(NH4)2SO46.02 g/L。从节约成本考虑,其他不显著因素均保持低水平浓度:酵母粉5.00 g/L、蔗糖5.00 g/L、豆粕粉5.00 g/L、MgSO40.20 g/L和K2HPO42.00 g/L。在该条件下,抑菌圈直径预测值为12.76 mm,实验测定值为12.92 mm,实验结果与模型预测值吻合,说明所建模型是切实可行的,优化后抑菌活力比优化前(10.62 mm)提高了21.66%,为BacilluscereusXH25大规模发酵产类细菌素奠定一定基础。

类细菌素,蜡样芽孢杆菌,培养基,响应面分析法

近年来,细菌耐药性的增加趋势使得在全世界范围内掀起了一股开发新型抗菌剂的热潮,其中天然抗菌物质作为潜在的新型生防资源已经成为了开发热点[1-2]。在这些潜在的天然抗菌物质中,细菌素和类细菌素是其中最重要和最有效的防止细菌耐药性产生的抗菌物质之一[3-5]。

细菌素和类细菌素是自然界普遍存在的蛋白类抗菌物质,具有高效、广谱、安全、无耐药性等特点[6-7],被认为是食品添加剂、化妆品、皮肤保健、抑制病原菌和调节肠道菌群的优选材料[8-10]。目前,国内外对细菌素和类细菌素的研究在乳酸菌中较为深入,对芽孢杆菌属的研究主要集中在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌当中,但研究不深入[11-12]。与乳酸菌相比,芽孢杆菌所产的细菌素或类细菌素种类丰富,具有更广的抗菌谱和更高的稳定性,在开发潜力方面优势明显[7,13-14]。

蜡样芽孢杆菌XH25菌株(BacilluscereusXH25)分离于中国传统中草药,对多种致病菌和食品腐败菌具有一定的拮抗作用。前期研究表明:该菌株拮抗作用的物质基础是类细菌素,不产生溶血性肠毒素HBL、非溶血性肠毒素Nhe、细胞毒素K和呕吐毒素[15]。因此,B.cereusXH25菌株作为产类细菌素的候选菌株具有良好的开发潜力。基于此,本研究采用响应面分析法对B.cereusXH25菌株产类细菌素的培养基进行优化,旨在为B.cereusXH25类细菌素的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验菌株:蜡样芽孢杆菌(BacilluscereusXH25)、金黄色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 9144) 西华大学食品与生物工程学院保藏。

MgSO4、(NH4)2SO4和K2HPO4成都市科龙化工试剂厂;可溶性淀粉和蔗糖 阿拉丁公司;酵母粉 美国OXOID公司;豆粕粉 山东万得福实业集团有限公司。

种子培养基(NB培养基);指示菌培养基(LB液体培养基);优化前发酵培养基(pH7.0、可溶性淀粉12.50 g/L、(NH4)2SO46.50 g/L、酵母5.00 g/L、蔗糖5.00 g/L、豆粕粉5.00 g/L、MgSO40.20 g/L和K2HPO42.00 g/L)。

TB-214电子天平 美国丹佛仪器公司;HH-S4数显恒温水浴锅 金坛市医疗仪器厂;3-18K冷冻离心机 Sigma公司;HZO-R恒温摇床 东联电子技术开发有限公司;pHS-3C数字酸度计 上海雷韵实验仪器制造有限公司;H97恒温磁力搅拌器 上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 类细菌素的制备 将B.cereusXH25接种于NB液体培养基中,37 ℃、200 r/min,培养18 h后,按1.00%接种量接种至发酵培养基中(40 mL/200 mL),37 ℃、200 r/min,发酵72 h。发酵液调pH至7.20,8000 r/min、4 ℃离心15 min,0.45 μm滤膜过滤上清液,滤液备用[4]。

1.2.2 抑菌活性测定 以金黄色葡萄球菌作指示菌,采用双层平板打孔法测定滤液中类细菌素的抑菌活性[16]。

1.2.3 实验设计和统计分析

1.2.3.1 Plackett-Burman(PB)设计 以类细菌素对金黄色葡萄球菌的抑制圈直径为响应值,用Design-Expert 7.0软件[17-18]对影响XH25菌株产类细菌素培养基的8个变量:可溶性淀粉(X1)、酵母粉(X2)、蔗糖(X3)、豆粕粉(X4)、MgSO4(X5)、(NH4)2SO4(X6)、K2HPO4(X7)和pH(X8)进行设计。其中,各变量的低水平和高水平分别编码为-1和+1,其值如表1。

表1 Plackett-Burman实验分析变量与水平

Table 1 Levels of the variables tested in the Plackett-Burman design

变量水平-1+1X1可溶性淀粉(g/L)5002000X2酵母粉(g/L)5001500X3蔗糖(g/L)5001500X4豆粕粉(g/L)5002000X5MgSO4(g/L)020030X6(NH4)2SO4(g/L)3001000X7K2HPO4(g/L)200600X8pH500800

1.2.3.2 最陡爬坡实验设计 根据PB实验结果设计最陡爬坡实验,以变量的偏回归系数设定显著因素的步长和变化方向,加速响应值逼近最大响应区间。

1.2.3.3 中心组合设计与模型验证 根据PB和最陡爬坡实验的结果,对显著因素作进一步优化。选择中心点实验次数为6、星号臂长为1.682的中心组合设计法进行实验,以实验数据为依据构建响应面模型,确定最佳培养基配方,并验证模型的有效性。

表2 中心组合变量水平设计表

Table 2 Levels of the variables tested in the central composite design

变量变量水平168210-1-1682X1(g/L)19201750150012501080X6(g/L)698650580510462X8684650600550516

1.2.3.4 统计分析 每个实验重复3次,取其平均值(相对误差小于5.00%),采用Design-Expert 7.0软件对实验结果进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 变量的响应效应分析

以变量的低水平和高水平值进行PB实验(N=12),PB设计与实验结果见表3。以表2实验值为响应值分析变量的影响效应(表4),结果表明:可溶性淀粉(X1)、酵母粉(X2)、豆粕粉(X4)和K2HPO4(X7)对抑菌圈值呈正效应;MgSO4(X5)、(NH4)2SO4(X6)和 pH(X8)对抑菌圈值呈负效应;蔗糖(X3)对抑菌圈值无影响。其中,可溶性淀粉(p=0.0016)、(NH4)2SO4(p=0.0087)和pH(p=0.0031)的p值均小于0.01,影响极显著,说明三者量的变化对菌株XH25产类细菌素的影响极大。因此,这三个变量作为极显著因素进行后续的最陡爬坡实验和响应面分析。

表3 Plackett-Burman实验设计方案与实验值

Table 3 The matrix of Plackett-Burman design and the observed values

实验次数X1X2X3X4X5X6X7X8实验值(mm)11111-1-11-111522-11-111-1-1184831-11-111-1-19424-111111-1-18525-1-1-11-111-18776-1-11-11-11179271-1-111111848811-1-1-11-11913911-1-11-11-1111410-111-1-1-111817111-111-11-1193212-1-1-1-1-1-1-1-1877

表4 偏回归系数及影响因子的显著性分析

Table 4 Partial regression coefficients and analyses of their significance

变量效应系数标准差F值p值X113706800621200700016∗∗X20700350062315000112∗X3000000006200010000X4010005006206404813X5-030-015006257900954X6-077-0380062377900087∗∗X70400200062102900491∗X8-110-0550062777900031∗∗

注:R2=0.9895;*:差异显著,即p<0.05;**:差异极显著,即p<0.01。

2.2 最大逼近区域探寻

依据PB对变量的评估结果,沿可溶性淀粉增加方向、(NH4)2SO4减少和pH降低方向探寻爬坡步长。在X1、X6和X8的爬坡新步长分别为2.50、-0.70和-0.50下,设计最陡爬坡实验(表5)。在可溶性淀粉15.00 g/L、(NH4)2SO45.80 g/L和pH6.00条件下,抑菌圈直径达最大值,为12.23 mm,表明:爬坡实验3是菌株XH25产类细菌素最佳培养基中三个极显著变量的最大逼近区域。

表5 最陡爬坡实验设计和结果

Table 5 Experimental design and response value of path of steepest ascent

项目X1X6X8实验值(mm)(1)PB设计基点1250650650(2)原始步长750350150(3)坡度068-038-055(4)响应范围=(2)×(3)510-133-083(5)爬坡步长=(4)×05a255-0665-0413(6)不大于取十分位的爬坡新步长250-070-050爬坡实验11000720700972爬坡实验212506506501018爬坡实验315005806001223爬坡实验41750510550957爬坡实验52000440500922

注:0.5a:依据PB实验结果利用最陡爬坡分析所得经验值。2.3 响应面模型构建

根据PB和最陡爬坡实验确定的因素和水平,以抑菌圈直径为响应值(Y),可溶性淀粉15.00 g/L、(NH4)2SO45.80 g/L、pH6.00为中心点,设计三因素五水平的变量值表(表2),在此基础上进行中心组合实验(表6),其中实验1～14是析因实验,实验15～20是中心实验。20个实验点分为析因点和零点,其中析因点为自变量取值在X1、X6、X8所构成的三围顶点,零点为区域的中心点,零点实验重复6次,用以估计实验误差。通过表6实验值的二次多元回归拟合,得到抑菌圈直径(Y)响应三变量的二次多项式模型:

Y=12.63+0.15X1+0.27X6+0.52X8-0.19X1X6+0.41X1X8+0.36X6X8-0.87X12-0.57X62-1.08X82

表6 中心组合实验设计与实验结果

Table 6 Experimental design and results of the central composite design

实验号X1X6X8抑菌圈直径(mm)实验值预测值1-1-1-198097721-1-19589633-11-1972995411-18819065-1-1194892661-11110210777-111108710898111116211659-1682009919921016820010501044110-168201028105912016820118011481300-16829048711400168210221046150001276126316000125812631700012821263180001239126319000125212632000012731263

表7 中心组合实验结果的回归分析

Table 7 Regression results from the data of central composite designed experiments

参数估计系数标准误差F值p值模型126301105419<00001∗∗X1015007345300592X60270073133600044∗∗X805200735159<00001∗∗X1X6-019009539100762X1X80410095189300014∗∗X6X80360095146200034∗∗X12-087007115039<00001∗∗X62-05700716415<00001∗∗X82-108007123306<00001∗∗

依据回归方程,利用Design-Expert 7.0软件绘制响应曲面和等高线图(图1～图3)。等高线的形状可以反映因素间交互作用的强弱,圆形表示交互作用不显著,椭圆形表示交互作用显著。图1中可溶性淀粉和(NH4)2SO4交互作用的等高线近似圆形,表明两者交互作用不显著;可溶性淀粉和pH(图2)、(NH4)2SO4和pH(图3)交互作用的等高线形状都是椭圆,则说明它们之间的交互作用显著,与表7分析结果一致。对模型方程求导得到最大预测响应值为12.76 mm,此时对应变量的最佳值:可溶性淀粉浓度为15.32 g/L,(NH4)2SO4浓度为6.02 g/L,培养基pH为6.15。

图1 可溶性淀粉和(NH4)2SO4的交互作用对抑菌活力影响的响应曲面(a)和等高线图(b)Fig.1 Response surface and contour plots of mutual-influence for soluble starch and ammonium sulphate on the inhibition zone

图2 可溶性淀粉和pH的交互作用对抑菌活力影响的响应曲面(a)和等高线图(b)Fig.2 Response surface and contour plots of mutual-influence for soluble starch and pH on the inhibition zone

图3 (NH4)2SO4和pH的交互作用对抑菌活力影响的响应曲面(a)和等高线图(b)Fig.3 Response surface and contour plots of mutual-influence for ammonium sulphate and pH on the inhibition zone

2.4 实验验证

为了验证预测值的真实性,按照响应面分析法得到的优化组合,并根据实际应用情况,以pH6.20、可溶性淀粉15.32 g/L、(NH4)2SO46.02 g/L,酵母粉、蔗糖、豆粕粉、MgSO4和K2HPO4保持低水平浓度分别为5.00、5.00、5.00、0.20和2.00 g/L进行发酵,发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为12.92 mm,该实验值与模型的预测值12.76 mm接近,从而验证了预测值的准确性,说明优化模型可靠。同时,与优化前(培养基:pH7.00、可溶性淀粉12.50 g/L、(NH4)2SO46.50 g/L、酵母5.00 g/L、蔗糖5.00 g/L、豆粕粉5.00 g/L、MgSO40.20 g/L和K2HPO42.00 g/L,抑菌圈直径10.62 mm)相比,抑菌圈直径提高了21.66%。安俊莹等[19]利用响应面法优化B.amyloliquefaciensZJHD-06 产类细菌素的发酵培养基,优化后得到的类细菌素对单核增生李斯特菌的抑菌圈直径增加了27.82%。Dominguez A P M等[4]利用响应面法优化B.cereus产类细菌素的培养基,提高了18.72%的产量(对金黄色葡萄菌抑菌圈直径的大小)。这些结果表明:响应面法优化所获的培养基能够明显提高目标菌株产类细菌素的产量。

3 结论

应用响应面分析法优化B.cereusXH25产类细菌素的培养基。PB实验对pH、可溶性淀粉、(NH4)2SO4、酵母粉、蔗糖、豆粕粉、MgSO4和K2HPO4进行考察,发现可溶性淀粉、(NH4)2SO4和pH对菌株XH25产类细菌素有显著影响;最陡爬坡实验进一步表明:菌株XH25产类细菌素最佳培养基的最大逼近区域在可溶性淀粉15.00 g/L、(NH4)2SO45.80 g/L和pH6.00附近。在此基础上,中心组合实验构建的二次多项式模型。优化实验确定培养基的最优组合为:培养基pH6.15、可溶性淀粉15.32 g/L、(NH4)2SO46.02 g/L,酵母粉、蔗糖、豆粕粉、MgSO4和K2HPO4浓度分别为5.00、5.00、5.00、0.20、2.00 g/L。在该条件下,实验值12.92 mm,与模型预测值12.76 mm接近,说明了优化模型可靠。同时,与优化前相比,发酵液的抑菌活力提高了21.66%,表明优化方案能明显提高XH25菌株产类细菌素的产量,为B.cereusXH25类细菌素的开发奠定了一定的基础。

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Optimization of fermentation medium ofBacilluscereusfor bacteriocin-like substance by response surface methodology

XU Gu-rong1,CHEN Zhi-wei1，*,ZHONG Xiao-ting2,XIONG Hua1,ZUO Xiao-ling1,ZHANG Qing1

(1.College of Food and Bioengineering,Xihua University,Key Laboratory of Food Biotechnology of Sichuan,Chengdu 610039,China； 2.Sichuan Qianhe Condiment and Food Co,Ltd,Meishan 620010,China)

Responsesurfacemethodologywasemployedtooptimizemediumcompositionfortheproductionofbacteriocin-likesubstancebyBacillus cereusXH25.ThePlackett-Burmendesignwasusedtoevaluatetheeffectsofdifferentcomponentsintheculturemedium.TheinitialpHofmedium,solublestarchand(NH4)2SO4werefoundtosignificantlyinfluencethebacteriocin-likesubstanceproduction.Thesteepestascentmethodwasundertakentoaccesstheoptimalregionoftheabovethreesignificantfactors,andthentheirconcentrationswereoptimizedbythecentralcompositedesignandtheresponsesurfacemethodology.TheresultsindicatedthattheoptimizedmediumwasinitialpHof6.15,solublestarchof15.32g/Land(NH4)2SO4of6.02g/L,andunderthiscondition.Consideringthecost,otherinsignificantfactorsweremaintainedatlowlevels:yeastpowderof5.00g/L,sucroseof5.00g/L,soybeanmealof5.00g/L,MgSO4of0.20g/LandK2HPO4of2.00g/LThepredictedvalue12.76mmwasverifiedsubsequentlybyvalidationexperimentsvalue12.92mm.Theexcellentcorrelationbetweenpredictedandobservedvaluesfurtherconfirmedtheadequacyandaccuracyofthemodelobtained.AndtheantibacterialactivityagainstStaphylococcus aureusATCC9144wasincreasedby21.66%comparedwiththeoriginalmedium,whichprovidedabasisforfurtherstudyonthelargescalebatchfermentationofproductionofbacteriocin-likesubstancebyB. cereusXH25.

bacteriocin-likesubstance;Bacillus cereus;fermentationmedium;responsesurfacemethodology

2016-04-21

徐顾榕(1992-)，女， 硕士研究生，研究方向:食品微生物分子生态，E-mail:xuluffy@sina.com。

*通讯作者:陈志伟(1973-)，男，硕士，高级实验师，研究方向:食品科学与工程, E-mail:19127720@qq.com。

粮油工程与食品安全四川省高校重点实验室开放基金(SZJJ2014-001)；西华大学重点科研基金项目(YCJJ2016146)。

TS201.2

B

1002-0306(2016)19-0212-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.033