一株铁皮石斛组织培养污染内生细菌的分离与鉴定

尹利方，陈泽斌, 2 *，夏体渊, 2 **，耿开友，赵 凤，靳 松，李静雯，牛燕芬

(1.昆明学院农学院，云南 昆明 650214；2.云南省都市特色农业工程技术研究中心，云南 昆明 650214；3.昆明学院科研处，云南 昆明 650214)



一株铁皮石斛组织培养污染内生细菌的分离与鉴定

尹利方1，陈泽斌1, 2 *，夏体渊1, 2 **，耿开友3，赵 凤3，靳 松1，李静雯1，牛燕芬1

(1.昆明学院农学院，云南 昆明 650214；2.云南省都市特色农业工程技术研究中心，云南 昆明 650214；3.昆明学院科研处，云南 昆明 650214)

对污染铁皮石斛组培苗的内生细菌进行分离和鉴定，为预防铁皮石斛组织培养过程中内生细菌污染提供科学依据。采用NA培养基分离纯化细菌，通过形态特征、生理生化指标结合16S rDNA序列同源性分析，对引起铁皮石斛组培苗污染的内生细菌进行鉴定。引起铁皮石斛组培苗污染的内生细菌为SH42菌株，其形态特征及生理生化指标与莫海威芽孢杆菌(Bacillusmojavensis)基本相同；16S rDNA序列分析结果表明，SH42与B.mojavensis(AM948970)聚在同一系统发育分支，其同源性为99.4 %。因此确定引起铁皮石斛组培苗污染的内生细菌SH42为莫海威芽孢杆菌。

铁皮石斛；组织培养；内生细菌；分离；鉴定

铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)，为兰科多年生附生草本植物。生于海拔1600 m的山地半阴湿的岩石上，喜温暖湿润气候和半阴半阳的环境，不耐寒。石斛可分为黄草、金钗、马鞭等数10种，铁皮石斛为石斛之极品，铁皮石斛因表皮呈铁绿色而得名[1]。铁皮石斛具有独特的药用价值，以其茎入药，中药名：石斛，属补益药中的补阴药，《中国药典》：益胃生津，滋阴清热[2]。多年以来，商品石斛主要依靠野生药用石斛资源，随着药用石斛开发利用的不断深入和国内外需求量的逐年增加，中国野生药用石斛资源遭到了严重破坏，有些地区甚至面临枯竭[3]。

铁皮石斛的种子极为细小，胚胎发育不完全，缺乏胚乳组织，萌发率极低(不足5 %)，且自然条件下必须与兰菌共生才能萌发。因此无法在大田或苗床上播种，很难生产足够的实生苗用于栽培。铁皮石斛对生长环境要求苛刻，成苗更困难。传统的人工繁殖方式如分株、扦插等，繁殖速度慢，增殖率很低。因此对其进行人工种苗组织培养快速繁殖技术研究是十分必要的[4]。但在植物组织培养过程中，普遍存在两种类型的污染：一类是通常所说的污染，即外植体消毒不彻底，无菌操作和培养过程中，如：培养基、接种工具、接种室消毒不严格或操作不规范而导致的污染；另一类是内生菌污染，内生菌包括真菌和细菌，本研究探讨的是内生细菌所致的污染[5-6]。在铁皮石斛组培快繁过程中，虽然对初代培养的外植体进行了严格的消毒灭菌，但10 d后发现严重的细菌污染，污染率高达10 %以上，一旦被污染，菌苔很快布满培养基表层及外植体的基部，大量消耗营养；外植体停止生长，逐渐枯萎死亡，严重影响组培苗的正常生长和继代。

关于内生细菌在植物组织培养中引起污染的报道，如金线莲(Anoectochilusroxburghii)组培中污染率达到50 %[7]，仙客来(Cyclamenpersicum)的块茎组织内生细菌污染率达83.0 %[8]，地黄(Rehmanniaglutinosa)由于有内生细菌的存在污染率达100 %等[9]。从已有的报道看，被鉴定的种类主要有黄单胞菌属(Xanthomonas)[10]、芽孢杆菌属(Bacillus)、萄球菌属(Staphylococcus)[11]、假单胞属(Pseudomonas)[12]、土壤杆菌属(Agrobacterium)[13]、葡肠杆菌属(Enterobacter)、棒杆状菌属(Corynebacterium) 、沙雷氏菌属(Serratia)、短小杆菌属(Curtobacterium)[14]、欧文氏菌属(Erwinia)[15-18]等。在组培苗内生菌污染防治的相关报道中，多采用对外植体进行预处理，比如：黄化处理、热击、多次消毒、灼烧、酸化培养基、在培养基中加入抗生素，特别是抗生素的使用具有较好的效果[12]。本研究通过NA培养基分离纯化内生细菌，再通过形态特征、生理生化指标结合16S rDNA序列同源性分析，对1株引起铁皮石斛组织培养污染的内生细菌进行了鉴定，为后期铁皮石斛组织培养污染的预防、无性繁殖技术体系的顺利建立提供重要的科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

污染的铁皮石斛组培苗由昆明学院农学院植物组织培养实验中心提供。

1.2 培养基

内生细菌分离和培养用NA培养基，液体培养用LB培养基，细菌DNA提取，16S rDNA片段扩增所用的各种酶、Marker、dNTPs、Buffer等试剂为宝生物工程(大连)产品，其余试剂均为国产分析纯。

1.3 细菌的分离纯化及保藏

挑取污染菌苔接种于NA培养基上进行划线纯化，挑取单菌落于试管斜面中4 ℃保存。

1.4 形态特征观察及生理生化指标的测定

参照文献[19]进行芽孢染色后在光学显微镜下观察并拍照。形态特征观察及生理生化试验参见《常见细菌系统鉴定手册》[20]，主要测定项目包括培养性状、菌体大小、甘露醇产酸、过氧化氢酶试、明胶液、酪蛋白水、苯丙氨酸脱氨、V-P反应、厌氧生长、还原硝酸盐、水解淀粉、D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露醇、葡萄糖产气、利用葡萄糖、利用蔗糖、利用麦芽糖、利用D-山梨醇、利用乳糖、利用异戊醇、利用蛋白胨、利用牛肉浸膏、利用酵母浸膏、利用KNO3、利用氯化铵。

1.5 16S rDNA序列分析

用TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0提取细菌基因组DNA，方法参见试剂盒说明书。PCR反应体系(50 μl)组成：10×PCR缓冲液5 μl，dNTPs (10 mmol/L) 4 μl，引物F27/R1492[20](10 μmol/L) 2 μl，模板DNA (约50 g/L) 1 μl，Taq酶2.5 U，双蒸水35.5 μl。PCR扩增按Sambrook方法进行[21]。扩增产物经TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0回收后，送上海桑尼生物科技有限公司进行序列测定。将测得的16S rDNA全序列用EzTaxon Server version 2.1(http://www.ezbiocloud.net/)进行同源性搜索[22]，通过MEGA4.0进行比对，随后选用Maximum Composite Likelihood距离模型进行UPGMA分析生成系统发育树，发育树用Bootstrap法(1000次重复)检验。用Megalign软件，将这些序列用Clustal W法进行多序列比对，建立系统发育进化距离图。

2 结果与分析

2.1 形态特征观察

菌株SH42(图1b)在NA培养基上呈乳白色不透明菌落，菌落卵状，边缘稍凸起，中间凹陷，表面干燥有褶皱，边缘不整齐；芽孢直杆状(图2)，约2 μm。依据常见细菌鉴定手册，生理生化指标均与莫海威芽孢杆菌(Bacillusmojavensis)特征相同(表1)。

a：被SH42污染的铁皮石斛组培苗；b：SH42在NA培养基上的菌落形态a：Dendrobium candidum’s cultivation seedling polluted by the strain SH42; b：Colony morphologies of SH42 on NA culture medium图1 菌株SH42的形态特征Fig.1 Morphology of strain SH42

图2 SH42的芽孢染色(放大1000×)Fig.2 Spore morphologies of strain SH42 under light microscopy (magnification, 1000×)

生理生化指标IndexesofphysiologyandbiochemistrySH42甘露醇产酸+过氧化氢酶试验+明胶液化+酪蛋白水解-苯丙氨酸脱氨-V⁃P反应+厌氧生长-还原硝酸盐+水解淀粉+D⁃葡萄糖+L⁃阿拉伯糖+D⁃木糖+D⁃甘露醇+葡萄糖产气-利用葡萄糖+利用蔗糖+利用麦芽糖+利用D⁃山梨醇+利用乳糖-利用异戊醇-利用蛋白胨+利用牛肉浸膏+利用酵母浸膏+利用KNO3-利用氯化铵-

2.2 16S rDNA序列分析

通过BankIt (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/WebSub/?tool=genbank)将本研究所得序列SH42提交到Genbank数据库中，登录号为KP900948。将菌株SH42的16S rDNA与从GenBank中获取与该菌株序列同源性较高的部分菌株16S rDNA序列构建系统发育树(表2、图3)，该菌株与B.mojavensis(AM948970)聚在同一系统发育分支(图3)。通过Megalign进行同源性比对发现，SH42与B.licheniformis(EF644414)同源性最高，达99.8 %，而与B.mojavensis(AM948970)同源性为99.4 %(图4)；系统发育树与系统发育进化距离表得出的结果不一致，但结合生理生化指标分析，将SH42鉴定为B.mojavensis。

3 讨 论

Leifert[23]等研究表明，在初代培养中，表面细菌引起的污染通常在2～3 d就能在外植体周围的培养基表面形成明显的水污状、油污状、气泡或干缩的红、黄、乳白等颜色的菌落；而在外植体培养后3～5 d后才出现的细菌菌落，则可能是由内生细菌引起的污染。本研究在对铁皮石斛组培苗污染情况调查时，发现在外植体培养后3～5 d没有细菌污染，而是在10 d后才出现的污染，所以推测可能是内生细菌引起的污染。

表2 用于构建系统发育树的菌株相关信息

括号中的序号为Genbank登录号；分支上的数字为自展值百分比；线段0.005为核酸替换率Genbank accession numbers were shown in the parentheses. The number at each branch point was the percentage supported by bootstrap. Bar: 0.0005 subsitutions per nucleotide position图3 基于16S rDNA序列的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence

图4 系统发育进化距离Fig.4 Sequence distance of SH42 based on 16S rDNA full-length sequence

在组培内生菌污染防治的研究中，在培养基中加入抗生素的方法已有报道。Reed等[24]在天竺葵(Pelargoniumhortorum)组培中发现头孢噻肟(Cefotaxime Sodium)的抑菌效果良好，且对芽的增殖有促进作用。韩美丽[25]等在绿巨人(Spathiphyllumkochii)组培中研究了青霉素钠、先锋霉素和庆大霉素对继代培养中细菌污染的抑制效果，结果表明先锋霉素的抑菌效果最好，青霉素钠和庆大霉素次之。本研究中16S rDNA序列分析和生理生化鉴定表明引起铁皮石斛组培苗污染的细菌是莫海威芽孢杆菌(Bacillusmojavensis)，属于革兰氏阳性菌，由于革兰氏阳性菌细胞壁的特殊成分，使大多数革兰氏阳性菌对青霉素敏感，因此，可以筛选出一部分既能抑制细菌生长但对植物的生长不产生影响的抗生素应用于铁皮石斛的组织培养。

从系统发育树(图3)来看，SH42与B.mojavensis(AM948970)聚在同一系统发育分支，但从同源性比对来看，SH42与B.licheniformis(EF644414)同源性最高，达99.8 %，而与B.mojavensis(AM948970)同源性为99.4 %，结合生理生化指标结果，最终将SH42鉴定为B.mojavensis。由此可见，基于16S rDNA序列分析的系统发育学研究有一定的局限性，16S rDNA序列同源性更适用于属以上分类单元，对于属以下分类单元分辨率明显低。在某些近缘种的鉴定中，如芽孢杆菌属中解淀粉芽孢杆菌近缘种，很难精确确定它们的分类地位。因此只有有效地将细菌经典分类学和现代分子分类学进行结合，将表型鉴定和分子生物学鉴定综合分析才能得出更为可靠的结论。

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(责任编辑 王家银)

Isolation and Identification of Pollution Endophytic Bacteria during Tissue Culture ofDendrobiumcandidum

YIN Li-fang1, CHEN Ze-bin1, 2 *, XIA Ti-yuan1, 2 **, GENG Kai-you3, ZHAO Feng3, JIN Song1, LI Jing-wen1, NIU Yan-fen1

(1.Agriculture College, Kunming University, Yunnan Kunming 650214, China;2.Engineering Research Center for Characteristics Agriculture of Yunnan Province, Yunnan Kunming 650214, China;3.Scientific Research Department, Kunming University, Yunnan Kunming 650214, China)

The advantaged endogenous bacteria, which caused contamination ofDendrobiumcandidumplantlets, was isolated and identified so as to provide scientific references for pollution prevention during its tissue culture. Using the NA culture medium to isolate the strain, the bacterial species were identified by morphology, biochemical and the sequence analysis of the 16S rDNA. The results from physiological and biochemical tests showed that the morphological characteristics of the strain SH42 matched the descriptions ofBacillusmojavensis. The sequence analysis of 16S rDNA indicated that this strain had the same embranchment with theB.mojavensis(AM948970) in the phylogenetic tree with the homology of 99.4 %. The SH42 strain was identified asB.mojavensis.

Dendrobiumcandidum; Tissue culture; Endophytic bacteria; Isolation; Identification

1001-4829(2016)08-1982-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.08.042

2015-03-26

云南省都市特色农业工程技术研究中心项目(TSNY0201)；国家自然科学基金项目(31460491)；云南省科技厅基础研究项目(2013FD040)；云南省教育厅科学研究项目(2014Y390)；昆明学院大学生科研项目(XJD16081)；昆明学院“人才引进项目”(YJL14005)；云南省高校优势特色重点学科(生态学)建设项目(05000511311)

尹利方(1981-)，女，云南昆明人，硕士，讲师，主要从事都市农业的教学科研工作，E-mail: 563454379@qq.com，*为共同第一作者，**为通讯作者，E-mail: xiatiyuan@sohu.com。

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