蝶豆的组织培养与快繁技术研究

闫海霞，蒋月喜，王晓国，何荆洲，黄昌艳，邓杰玲，卜朝阳

(广西壮族自治区农业科学院花卉研究所，广西 南宁 530007)



蝶豆的组织培养与快繁技术研究

闫海霞，蒋月喜*，王晓国，何荆洲，黄昌艳，邓杰玲，卜朝阳**

(广西壮族自治区农业科学院花卉研究所，广西 南宁 530007)

通过蝶豆种子无菌萌发，筛选出各培养阶段的适宜培养基，为建立蝶豆的组织培养与快繁技术提供参考。结果表明：采用75 %酒精表面灭菌30 s结合0.1 %的HgCl2表面灭菌10 min的方法，蝶豆的种子无菌萌发时污染率为0，发芽率为36.67 %；下胚轴、上胚轴、子叶的愈伤诱导率为100.00 %，愈伤分化率分别为82.11 %、20.00 %、0；愈伤分化的最佳培养基为MS+6-BA 0.10 mg/L+NAA 0.02 mg/L；上胚轴和下胚轴不能直接诱导出不定芽，子叶可以直接诱导出不定芽；不定芽增殖的适宜培养基为MS+6-BA 1.00 mg/L+IBA 0.50 mg/L；生根适宜培养基为MS+IBA 0.30 mg/L或者1/2 MS+IBA 0.30 mg/L。

蝶豆；无菌萌发；愈伤组织；不定芽

蝶豆(ClitoriaternateaL.)属蝶形花科(Papilionaceae)蝶豆属(Clitoria)，别名为蓝花豆，蝴蝶花豆，蓝蝴蝶。其原产印度、印度尼西亚，现世界上热带和亚热带地区广泛栽培。蝶豆的用途广泛，花朵可以提取天然染料，嫩夹可以食用，根可以入药；此外，蝶豆还可制成干草用作饲料。近年来蝶豆在园林植物造景配置中得到越来越多的应用，主要用于花坛、庭园围篱蔓爬、盆栽、垂吊，特别是在广东沿海一带，常作为盆栽藤蔓观赏花卉[1]和主要的垂直绿化植物[2]。国内有关蝶豆的相关研究较少，主要停留在一些特性描述[3]、种子萌发[4]、常规栽培技术[5]以及药用价值[6-8]等方面，其中余玲[3]对蝶豆的形态以及农学性状进行了描述，指出蝶豆的用途包括：调制干草、绿肥植物、植被复原、观赏植物、高级油料、药用和食品染料(花中含有比较稳定的天然染料)；闫海霞等[4]研究结果表明：蝶豆种子萌发的需光性为不敏感的中性特征；温度是决定蝶豆种子萌发的主要因素，适宜的萌发温度为20～30 ℃；在40～60 ℃的温汤中浸种可有效提高其发芽率。蝶豆种子发芽率普遍较低，尽管采用某些物理或化学处理方法可以提高其发芽率，例如贮藏6个月后再进行萌发，发芽率可达15.00 %～20.00 %[5]；萌发前采用热水、硫酸和KOH进行预处理，萌发率可提高[9]；采用机械划破来种皮可将发芽率从30.00 %增加到71.00 %[3]。但是常规的种子繁殖方法存在速度慢、繁殖系数低的问题，而组织培养及快繁技术则可解决此缺点。此外，通过组培快繁获得的繁殖后代整齐一致，能保持原有品种的优良性状。目前尚未有蝶豆组织培养的相关研究报道。本研究以蝶豆当年采收的种子为材料，通过无菌播种，筛选出各培养阶段所需要的适宜培养基，以期建立蝶豆组织培养与快繁体系，为其遗传转化提供理论和技术基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

蝶豆种子为当年采收，由广西农业科学院花卉研究所提供。

1.2 培养基及培养条件

MS培养基和1/2 MS培养基(MS培养基大量元素用量减半)，蔗糖30 g/L，琼脂3.5～4.0 g/L，pH 5.8～6.2。培养温度为(25±1) ℃，每日光照12 h。

1.3 试验方法

1.3.1 种子的无菌萌发 选用饱满种子，自来水冲洗30 min后，先用75 %的酒精进行表面灭菌，无菌水冲洗3遍，再用0.1 % HgCl2进行表面灭菌，无菌水冲洗3遍。酒精和HgCl2的具体灭菌时间如表1。灭菌后将种子放入40～60 ℃无菌水浸种10～15 min，置于室温下24 h后接入MS培养基中。以后每天观察种子污染以及发芽情况，15 d后统计污染率和发芽率。

表1 蝶豆种子的灭菌时间组合

表2 愈伤分化培养基的不同激素配比

Table 2 The different hormone combinations of callus differentiation medium

处理Treatment培养基Medium6⁃BA(mg/L)NAA(mg/L)F1MS0．100．02F2MS0．100．10F3MS0．500．02F4MS0．500．10F5MS1．000．02F6MS1．000．10

污染率( %)=污染数/接种数×100

发芽率( %)=萌发数/接种数×100

1.3.2 愈伤组织的诱导 将种子萌发后的小苗(子叶已展开)的上胚轴、下胚轴，带子叶茎段切成长为10 mm的小段，接种在MS培养基上。每天观察诱导情况，20 d后统计愈伤诱导率和愈伤分化率。

愈伤诱导率( %)=产生愈伤数/接种数×100

愈伤分化率( %)=发生愈伤分化数/接种数×100

1.3.3 愈伤组织的分化 将愈伤组织切割成5 mm×5 mm小块，接种在表2的培养基上。观察愈伤分化的情况，20 d后统计愈伤分化数。分化系数的计算公式为：分化系数=分化数/接种数。

1.3.4 不定芽的增殖 将种子萌发后得到的小苗切成10 mm的茎段，分别接种于表3的培养基上。观察并统计不定芽的增殖的情况，连续观察20 d，并计算增殖系数，增殖系数=新芽数/接种数。

1.3.5 生根培养 当小苗长至高约2.0～3.5 cm时，转接于表4的培养基中。20 d后观察并统计生根的情况，计算生根率，生根率( %)=生根数/接种数×100。

表3 不定芽增殖的不同培养基

表4 生根培养基

表5 不同消毒处理方式对蝶豆种子无菌萌发的影响

注：同列数据后不同小写字母表示差异达显著水平(P<0.05)。下同。

Note： Different lowercase alphabets in the same column indicate significant difference at 0.05 level. The same as below.

1.4 统计分析

采用SPSS13.0软件进行差异显著性测验(Duncan’s多重比较)。

2 结果与分析

2.1 种子的无菌萌发

由表5可以看出，随着酒精表面灭菌时间的增加，污染数、污染率降低，直至为0，其中D1处理污染数、污染率均显著高于D2和D3处理(P<0.05，下同)，D2和D3处理间差异不显著(P>0.05，下同)，表明酒精的灭菌时间越长，不同处理间污染数和污染率的差异越不显著。D2处理发芽数、发芽率均显著高于D1和D3处理，D1和D3处理间差异不显著，表明发芽率受酒精灭菌时间的影响表现为先升高后降低，综上可知， D2处理是最适宜的蝶豆种子灭菌方法，即75 %酒精30 s结合0.1 % HgCl2灭菌10 min时效果最佳，污染率为0，发芽率为36.67 %。

2.2 愈伤组织的诱导

由表6可知，不同的外植体对愈伤诱导率的影响差异不显著，即下胚轴、上胚轴、子叶接种在MS培养基的愈伤诱导率均为100.00 %。但是不同接种外植体类型间愈伤分化率均存在显著差异，愈伤分化率从高到低的顺序为：下胚轴>上胚轴>子叶，分别为82.11 %、20.00 %、0。此外，从生长情况记录可知：上胚轴和下胚轴仅可诱导出愈伤组织，不能直接诱导出不定芽；而子叶可以直接诱导出不定芽，不定芽从子叶顶部出芽。

2.3 愈伤组织的分化

由表7可知：F1处理的分化数和分化系数除与F2处理差异均不显著外，均显著高于其他处理；F6处理的分化数和分化系数显著低于其他处理，其余处理间分化数和分化系数差异均不显著。由此可见，较低浓度的6-BA对分化数、分化系数无显著差异，当6-BA浓度达到一定水平时，其对分化数、分化系数的影响有显著差异，浓度越高，分化数、分化系数越低。在NAA浓度一定的条件下，随着6-BA浓度的增加，分化数、分化系数的差异不显著。F1和F6处理间存在显著差异，F1处理的分化系数远高于F6处理的分化系数，这结果符合快繁的要求。

表6 蝶豆的愈伤诱导情况

表7 不同激素配比对蝶豆愈伤组织分化的影响

表8 不同培养基对蝶豆不定芽增殖的影响

由此可知：影响愈伤分化的最佳培养基为：MS+6-BA 0.10 mg/L+NAA 0.02 mg/L，分化系数达4.0，愈伤组织上的芽点多，小苗长势好，健壮。

2.4 不定芽的增殖

从表8可以看出，H2处理的增殖系数显著高于H1处理，H2与H3的增殖系数无显著差异，H4、H5、H6的增殖系数无显著差异，H7、H8、H9的增殖系数无显著差异。由此表明，蝶豆的不定芽增殖受激素种类和浓度的影响。在相同浓度的IBA条件下，随着6-BA浓度的升高新芽数、增殖系数在下降，6-BA浓度与不定芽增殖呈负相关；在相同浓度的6-BA条件下，随着IBA浓度不同增殖系数略有差异，当6-BA浓度为1.50 mg/L或者2.00 mg/L时，IBA的浓度对新芽数、增殖系数的影响不显著，当6-BA浓度为1.00 mg/L时，IBA浓度为0.50 mg/L时对新芽数、增殖系数的影响最大，小苗的长势好，植株健壮。综合增殖系数、幼苗生长状况可知，蝶豆不定芽增殖的适宜培养基为MS+6-BA 1.00 mg/L+IBA 0.50 mg/L，增殖系数为3.75，小苗长势好，植株健壮。

2.5 生根培养

从表9可以看出，S3与S6处理生根率最高，均为100.00 %，两者显著高于其他处理；S1处理生根率最低，为92.20 %，与S4处理差异不显著，但显著低于S2、S3、S5、S6处理。S1和S4、S2和S5、S3和S6处理间的生根率差异不显著。由此表明，蝶豆的生根受基本培养基的影响不显著，MS、1/2 MS对蝶豆的生根不具有选择性，而受激素的影响显著，IBA对蝶豆的生根有重要的调节作用。进一步分析得出，在同一基本培养上，随着IBA浓度增加，生根率随之提高，表现出IBA对蝶豆的生根呈正相关显著。当IBA浓度为0.30 mg/L时，生根数最多，生根率达最高，为100.00 %。由此可知，蝶豆的最适生根培养基为MS+IBA 0.30 mg/L或者1/2 MS+IBA 0.30 mg/L，生根率100.00 %，小苗长势好。

3 结论与讨论

在本试验中，蝶豆种子通过无菌萌发的发芽率普遍较低，仅有36.67 %，这与本研究团队之前在常规条件下的研究结果相一致[4]。虽然无菌播种能够提供一个适宜的环境条件，但是种子的萌发受多种因素的影响，其中自身的特性是主要因素。豆科植物种皮具有不透水的特性，蝶豆作为豆科植物中的一种，也具备这种特性。其萌发率低，原因可能是种子硬实，有较坚硬的外壳，种子难以吸收水分和氧气，从而影响了萌发[4]。尽管种子的萌发率低，但通过继代增殖培养，仍然可以达到快速繁殖的目的。

表9 不同培养基对蝶豆生根诱导的影响

植物由外植体诱导体细胞胚胎的发生分为愈伤途径和不定芽途径。愈伤途径指外植体先脱分化为愈伤组织，再由愈伤组织分化形成丛生芽，然后生根形成完整植株。不定芽途径指不经愈伤组织阶段而直接脱分化产生器官。本研究结果得出，蝶豆的上胚轴和下胚轴仅可诱导出愈伤组织，不能直接诱导出不定芽，此结果和郭刚等[10]、龚真才等[11]对豆科植物苦马豆的研究相一致。本研究子叶愈伤诱导率为100.00 %，但愈伤分化率分别为0，子叶可以直接诱导出不定芽，不定芽从子叶顶部出芽，意即以子叶为外植体进行组培快繁，仅可通过不定芽途径，这有可能是植物本身的基因型决定的。利用上胚轴和下胚轴进行不定芽诱导没有获得成功，原因可能是：一方面是激素浓度配比不适宜，没有达到一个较适合的浓度配比。在植物组织培养中，内源激素与外源激素起着重要的调控作用，植物生长调节剂的种类、水平以及组合的选择对组织的产生与分化十分重要[12]。因此，利用上胚轴和下胚轴通过不定芽途径能否建立起组培快繁技术还有待于进一步地研究。另一方面子叶(茎尖)作为生长最快的部位，细胞分裂生长快，生长点较多，内源激素也充足，上胚轴和下胚轴的作为较成熟的部位，其细胞分裂生长较子叶慢，内源激素比子叶的少，因而只能产生愈伤组织，不能直接诱导出不定芽。这也说明了不同外植体在诱导不定芽能力上是存在差别，可能是这种差别影响了愈伤组织的分化能力[13]。由上可知，蝶豆通过愈伤途径和不定芽途径均可获得组培植株。

综上所述，蝶豆的种子无菌萌发以75 %酒精表面灭菌30 s结合0.1 %的HgCl2表面灭菌10 min，污染率为0，发芽率为36.67 %。通过愈伤组织途径以及不定芽途径均可建立蝶豆的组培快繁体系。通过愈伤组织途径，下胚轴、上胚轴、子叶的愈伤诱导率为100.00 %，愈伤分化率分别为：82.11 %、20.00 %、0。愈伤分化的最佳培养基为：MS+6-BA 0.10 mg/L+NAA 0.02 mg/L，分化系数达4.0。通过不定芽途径，仅子叶可以直接诱导出不定芽，而上胚轴和下胚轴不能直接诱导出不定芽，不定芽增殖的最适宜培养基为MS+6-BA 1.00 mg/L+IBA 0.50 mg/L，增殖系数为3.75。蝶豆组培苗的最佳生根培养基为MS+IBA 0.30 mg/L或者1/2 MS+IBA 0.30 mg/L，生根率达100.00 %。

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(责任编辑 思利华)

Study on Tissue Culture and Rapid Propagation ofClitoriaternateaL.

YAN Hai-xia,JIANG Yue-xi*,WANG Xiao-guo, HE Jing-zhou, HUANG Chang-yan,DENG Jie-ling, BU Zhao-yang**

(Flower Research Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Guangxi Nanning 530007,China)

The suitable medium for varied stages was screened out by axenic germination ofClitoriaternateaL. to provide references for tissue culture and rapid regeneration ofClitoriaternateaL. The results showed that: by the method of 75 % ethanol for 30 s+0.1 % HgCl2for 10 min, the contamination rate was 0 and the germination rate was 36.67 % when the seeds were aseptic budding. The callus induction rate of hypocotyls, epicotyls, and cotyledon was 100.00 % and the rate of callus differentiation was 82.11 %, 20.00 % and 0, respectively. The optimizing medium for callus differentiation was MS+6-BA 0.10 mg/L+NAA 0.02 mg/L. Adventitious buds cannot be induced directly from epicotyl and hypocotyl, but can be induced directly from cotyledon. The optimizing medium for adventitious bud multiplication is MS+6-BA 1.00 mg/L+IBA 0.50 mg/L. The most suitable medium for adventitious root is MS+IBA0.30 mg/L or 1/2MS+IBA0.30 mg/L.

ClitoriaternateaL.; Axenic germination; Callus; Adventitious bud

1001-4829(2016)08-1977-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.08.041

2016-04-15

广西科学研究与技术开发项目(桂科能1598022-1-5，桂科攻1598006-5-8)；广西农业科学院科研团队项目(2015YT89)

闫海霞(1981-)，女，广西贵港人，硕士，助理研究员，主要从事花卉新品种选育与示范推广工作；E-mail：yangnv@126.com，*为并列第一作者，蒋月喜(1963-)，男，广西灌阳人，主要从事花卉新品种选育及示范推广工作,**为通讯作者。

S682.39

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