广西香蕉种质资源的SSR分析

孙嘉曼，尹 玲，张进忠，韦绍龙，李朝生，刘金成，卢 江*

(1.广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室,广西 南宁 530007；2.广西农业科学院生物技术研究所,广西 南宁 530007)



广西香蕉种质资源的SSR分析

孙嘉曼1，尹 玲1，张进忠2，韦绍龙2，李朝生2，刘金成1，卢 江1*

(1.广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室,广西 南宁 530007；2.广西农业科学院生物技术研究所,广西 南宁 530007)

研究广西特色香蕉种质资源的遗传多样性和亲缘关系，为香蕉种质资源分类、品种鉴定和有效利用提供理论参考。采用13对SSR荧光标记引物，对收集到的24份广西主栽香蕉品种及特色种质资源进行扩增，采用毛细管电泳对其进行基因分型。共扩增得到131个等位基因，平均每对引物扩增得到10.1个等位基因。引物的多态性信息含量(PIC)为0.65～0.87，平均0.77。在相似系数0.85附近，24个香蕉品种划分为4个大类：第一大类包含栽培种的香牙蕉和广西各地区的野生近缘种，第二大类为大蕉，第三大类为粉蕉，第四大类为贡蕉。从收集到的野生资源中筛选与栽培种亲缘关系较近、且具有良好抗病性的品种，可作为抗病育种的中间材料，并从分子角度入手挖掘优良的基因加以应用。

香蕉；SSR标记；指纹图谱；广西

香蕉属芭蕉科(Musaceae)芭蕉属(Musa)单子叶植物，是著名的亚热带水果，也是热带地区的主要粮食作物[1]。香蕉栽培品种是由尖叶蕉(记为A基因组)和长梗蕉(记为B基因组)这两个野生蕉的种内或种间杂交后进化而成，多为三倍体[2]。除三倍体外，还有少量的二倍体和四倍体品种(系)。当前，香蕉枯萎病是阻碍香蕉产业发展主要的问题。由于栽培品种香蕉的三倍体特性、不育性以及目前抗性材料的匮乏，应用传统的杂交育种方法进行品种创新的难度较大，杂交抗病育种进展缓慢，取得的成功有限。生产中栽培的大多数香蕉品种都是通过体细胞无性系变异获得的，无性繁殖并未引起基因多样性的变化。由于香蕉品种的规模化和单一化种植，导致遗传多样性减少，品种的抗逆性不断下降。如不引入外源野生型或其他基因型香蕉的基因，或很难通过自身或者传统育种的方法增加其基因多样性。

广西是全国重要的香蕉产区及优质香蕉货源地，香蕉种植面积占全国29 %，产量占广西水果总产量的三分之一，重点产区的香蕉生产已成为当地的主要农业产业。目前广西的主栽香蕉品种为Williams品系的“桂蕉1号”和“桂蕉6号”，其他蕉类有少量种植。另外，广西具有丰富的野生蕉类资源，分布在桂林、凭祥、防城等地。面对繁多的品种资源，利用传统的形态特征进行分类鉴定具有一定的局限性[3]。结合分子标记技术对香蕉种质资源进行品种鉴定、亲缘关系分析、遗传多样性等研究尤为必要。从众多的香蕉种质资源中挖掘遗传多样性高、具有良好抗逆性的品种加以利用，成为香蕉抗病育种的途径之一。

SSR(Simple Sequence Repeat)标记，又称微卫星分子标记(Microsatellite，MS)，是目前最常用的分子标记之一。SSR标记原理简单，具有高度的多态性、共显性遗传、引物公开且易获得、试验重复性高、操作简单、易于分析等优点[4-6]。SSR标记已广泛应用于香蕉种质资源的品种鉴定、遗传图谱构建及亲缘关系分析等[7-10]。

本研究选用已开发的SSR荧光标记引物，对收集及诱变育种获得的广西香蕉种质资源共24个样品进行扩增，利用毛细管电泳技术对扩增产物进行分离，从分子水平上阐明这些香蕉品种之间的亲缘关系，进行品种间遗传改良，可为评价香蕉种质资源的亲缘关系提供理论依据，对培育香蕉抗病品种、防控香蕉枯萎病乃至促进香蕉产业发展均具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试香蕉材料主要由广西农业科学院生物技术研究所提供，部分材料采集自广西各市县(表1)。选取生长健壮植株的健康幼嫩叶片，保存于-80 ℃备用。

表1 用于SSR分析的香蕉品种

1.2 基因组DNA提取

采用CTAB法[11]提取叶片DNA，具体步骤如下：取适量嫩叶加入液氮快速研磨成粉，取0.1 g于2 mL离心管中；加入700 μl CTAB提取缓冲液[2 % CTAB，20 mmol·L-1EDTA，1.4 mol·L-1NaCl，100 mmol·L-1Tris-HCl buffer(pH 8.0)]，摇匀，60 ℃水浴30 min；加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，13 000 g，4 ℃离心5 min，转移上清；上清液加1 μl RNA酶37 ℃反应1 h；再加入氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提1遍；加入等体积预冷异丙醇，-20 ℃下沉淀2 h，离心，去上清；沉淀用70 %乙醇清洗2～3次；用灭菌的ddH2O溶解DNA。

1.3 SSR引物选择

从已报道[7,12]的一些香蕉品种鉴定或指纹图谱构建的引物中选择多态性较高的13对引物用于试验，引物序列见表2。所有正向引物5’端使用荧光标记。引物AGMI35/36、AGMI121/122、AGMI123/124、ITBB01使用5’-HEX(六氯荧光素)标记；其余引物使用5’-FAM(羟基荧光素)标记。所有供试引物交由上海生工生物技术有限公司合成。

1.4 PCR扩增

PCR扩增反应体系总体积为20 μl，包含2 μl 10×PCR Buffer、0.2 mmol/L dNTP、10 μmol·L-1正反向引物各2 μl、3 ng/μl DNA模板和0.05 U/μlTaq酶。反应条件为94 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环，最后72 ℃延伸10 min，扩增产物4 ℃保存。

1.5 琼脂糖凝胶电泳及毛细管电泳

用2 %(w)琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，凝胶成像系统观察扩增结果并保存图像，确定PCR反应是否成功。将扩增成功的PCR产物进行纯化，取1 μl纯化后产物，加入0.5 μl分子量内标和8.5 μl甲酰胺，置于96孔板中；95 ℃变性5 min，用ABI 3730XL进行上机检测。

1.6 数据分析

参照尹玲等[13]的方法，利用GeneMapper v3.2软件分析产物大小，分析结果以Excel表的形式导出。根据毛细管电泳检测的峰图和每个峰值的大小，对供试24份香蕉种质材料的基因型数据进行判读与整理，建立不同品种的分子标记图谱[14]。采用NTSYS2.1[15]软件计算遗传距离，然后用非加权对群数学平均法(UPGMA)进行聚类分析，建立树状聚类图，分析各样本之间的亲缘关系。

表2 SSR引物

表3 13对引物扩增出的等位基因数量及多态性信息含量

2 结果与分析

2.1 引物扩增结果多态性分析

供试的13对引物扩增条带清晰且特异，表现出高度的多态性。每对引物扩增出的等位基因数量及多态性信息含量如表3所示。供试的24份香蕉材料中共扩增得到131个等位基因，平均每对引物扩增得到10.1个等位基因。引物的多态性信息含量(PIC)为0.65～0.87，平均0.77。其中，引物AGMI123/124扩增得到的等位基因数目最多，可以检测到17个等位基因；引物AGMI35/36、ITBB02和ITBB05扩增得到的等位基因均为最少(7个)。

2.2 DNA指纹图谱

二倍体野生蕉的基因型在毛细管电泳峰图中表现为明显的单峰，而主栽的三倍体品种则表现为三峰。“桂蕉6号”、“桂蕉9号”、“巴西蕉”在ITBB01位点上的带型相同，为148∶151∶154；而在AGMI123/124位点上，“桂蕉6号”、“桂蕉9号”的带型一致为278∶300∶354，“巴西蕉”的则为298∶300∶336∶338。这些指纹图谱为香蕉品种鉴定提供了很好的依据。

2.3 香蕉品种的亲缘关系分析

对13对引物的扩增结果进行统计，根据各香蕉品种之间的相似系数，对所有品种进行聚类分析，聚类结果如图1所示。从图1中可以看出，在相似系数0.85附近，可将供试24个香蕉品种分为4大聚类组。

第一大类：共有21个品种。第一大类可进一步分为4个组。其中第Ⅰ组包括“桂蕉1号”、“桂蕉6号”、“桂蕉9号”、T1-1、T1-2、T1-3、T1-4、T1-5、Williams突变体(Williams-M1)。这些都是AAA基因组的香牙蕉。第Ⅱ组包括防城二倍体、桂林二倍体、WB-M1、WB-M2、WB-M3、WB-M4、WB-M5、“巴西蕉”、M-hd1、M-hd2。其中WB-M1、WB-M2、WB-M3、WB-M4、WB-M5是由防城二倍体诱导突变产生的突变体。从图1中可以看出，这几个品种都聚在一起。WB-M5相比较其他几个突变体，与防城二倍体(WB-FC)的遗传关系最远，而WB-M2与WB-FC的亲缘关系最近。凭祥二倍体(WB-PX)(AA)为第Ⅲ组，采集自广西靖西县的土蕉(Tujiao)为第Ⅳ组。

第二大类是从广西象州采集的大蕉(ABB)品种。第三大类是粉蕉品种金粉1号(ABB)。第四大类是贡蕉(AA)。

3 结论与讨论

本研究应用已开发的13对SSR引物对24个香蕉品种的基因组DNA进行扩增，共扩增得到131个等位基因。通过基于SSR数据的树状聚类分析，将广西的24份香蕉种质分为4类，这与传统的形态学分类结果一致。Ning等[12]利用SSR标记对NBGCC收集的香蕉种质资源进行了遗传多样性分析；王静毅等[16]采用SSR标记技术构建了部分香蕉品种的分子指纹图谱，为香蕉品种鉴定提供依据；余智城等[17]应用植株形态特征和SSR分子标记，将选育的13份优良三倍体材料与漳州地区主栽品种共20份材料进行遗传多样性比较分析。本研究的结果与这些报道一致。

图1 香蕉品种基于SSR的树状聚类分析Fig.1 Dendrogram of banana cultivars based on SSR markers

本研究结果表明，聚为第一大类的种质资源包含了栽培种的香牙蕉类和从广西各地收集的野生近缘种，栽培的三倍体品种与野生二倍体的亲缘关系较近。由此，可以从收集到的野生资源中筛选与栽培种亲缘关系较近、且具有良好抗病性的品种，作为抗病育种的中间材料，从分子角度入手挖掘优良的基因并加以应用。然而，M-hd1与M-hd2，T1-2、T1-3、T1-4与T1-5是通过无性系变异筛选获得的，相互之间的差异很小，这些品种相似性为100 %的结果也表明，这些SSR位点不能将Cavendish亚组的品种完全区分开。

由于香蕉传统杂交育种的难度较大，目前针对香蕉产业中危害严重的枯萎病问题，国内香蕉育种工作都把重点放在从AAA基因型的品系中筛选新的抗性突变体。许多新选育的香蕉品种都是香牙蕉类，其遗传基础狭窄，遗传多样性相对较低，目前已开发的SSR引物在鉴别AAA基因型尤其是Cavendish亚组的品种方面表现出一定的局限性，这与Ning等[12]的研究结果一致。可以探索用其他分子标记技术开展相关研究，为近似品种的鉴定提供理论依据和参考。

相对于AAA基因型的品种，含有B基因组的品种及AA型的品种具有较高的遗传多样性，这些品种可以作为未来香蕉抗性育种的丰富资源。也可以从这些品种中开发新的SSR标记，对香蕉种质资源进行分类，对形态学分类和鉴定的局限性进行补充，从而完善和丰富香蕉品种的数据库。

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(责任编辑 温国泉)

SSR Analysis of Banana Cultivars/Accessions in Guangxi

SUN Jia-man1, YIN Ling1, ZHANG Jin-zhong2,WEI Shao-long2, LI Chao-sheng2, LIU Jin-cheng1, LU Jiang1*

(1. Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Key Lab, Guangxi Nanning 530007, China; 2. Institute of Biotechnology of Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Guangxi Nanning 530007, China)

The genetic relationship of banana germplasm in Guangxi was defined to provide references for classification, identification and utilization of banana. 24 banana cultivars and wild germplasm collections were analyzed with SSR markers. Twenty-four banana cultivars/accessions were genotyped with 13 pairs of fluorescence labeled SSR primers by capillary electrophoresis. We amplified 131 alleles, with the average of 10.1 alleles for each primer amplification. The polymorphism information content(PIC) was 0.65-0.87(average value of 0.77). Twenty-four banana cultivars/accessions were grouped into 4 clusters based on the similarity coefficient of 0.85. The first group includesMusaAAA Cavendish and wild relatives of banana collected from Guangxi.The second group is plantain, and the other two groups are dwarf banana andMusaAA Pisang, respectively. The good disease-resistance varieties, which had close genetic relationship with cultivated varieties, would be selected from wild germplasm and be used as the middle materials of disease-resistant breeding. From these varieties good genes could be explored and utilized.

Banana；SSR marker；DNA fingerprint；Guangxi

1001-4829(2016)08-1952-06

10.16213/j.cnki.scjas.2016.08.036

2016-04-20

广西自然科学基金项目(2015GXNSFDA139014)；广西农业科学院科技发展基金(2015JZ07)；广西八桂学者专项经费项目([2013]3号)；现代农业产业技术体系建设项目(nycytxgxcxtd-04-18)；广西农业科学院基本科研业务专项项目(2015YT53)

孙嘉曼(1986-)，女，陕西咸阳人，博士，助理研究员，主要从事植物功能基因组和分子育种研究，E-mail：jiamansun@hotmail.com,*为通讯作者，E-mail：jiang.lu.cau@gmail.com。

S668.1

A