灰飞虱携带的水稻条纹病毒NS2和NS3基因的分子变异

任春梅，程兆榜，杨 柳，缪 倩，周益军

(江苏省农业科学院植物保护研究所，江苏 南京 210014)



灰飞虱携带的水稻条纹病毒NS2和NS3基因的分子变异

任春梅，程兆榜*，杨 柳，缪 倩，周益军

(江苏省农业科学院植物保护研究所，江苏 南京 210014)

为揭示灰飞虱携带水稻条纹病毒(ricestripevirus, RSV)的NS2和NS3基因分子变异特征，采用单雌产卵法从江苏、云南、山东、河北等地获得20个灰飞虱携带的RSV分离物，RT-PCR扩增出NS2和NS3基因特异片段，并对扩增产物进行克隆测序，再结合Genbank中已报道的其他分离物序列，利用生物信息学软件分析不同寄主、地区分离物的分子变异特点及系统发育关系。序列测定表明，20个分离物NS2和NS3 2个基因核苷酸序列同源性分别为96.5 %～100 %(NS2)和95.4 %～100 %(NS3)，推导编码的蛋白氨基酸序列同源性为97.0 %～100 %(NS2)和96.2 %～100 %(NS3)。基于核苷酸序列构建的系统进化树分析表明2个基因均可以明显分为2组，其中一组均为中国云南水稻上的分离物，2组间遗传距离分别为0.05711(NS2)和0.06081(NS3)，2基因的Z-test的检测结果表明都处于强烈的负选择压下。从2基因氨基酸构建的系统发育树和变异热点上分析，其氨基酸序列的分子变异首先与地缘相关，2基因均可以分成中国云南及云南以外的2个地理亚群；其次与寄主相关，可以划分为灰飞虱和水稻2个寄主群。

水稻条纹病毒；NS2和NS3基因；分子变异；寄主群；地理亚群

植物病毒的群体遗传结构不仅可为我们追踪病毒的起源、进化和流行途径提供重要依据，同时其遗传结构及演化机制还直接影响着病毒病害的发生、发展和控制。病毒病的发生和流行是寄主、病毒、介体以及环境等各因子相互作用的结果，各因子相互作用、相互制约形成了一个变化的植物病毒动态体系。其中病原物的群体多样性是环境适应力的重要指标，高遗传多样性的病原物具有相对强的生存能力和进化优势，能更快地适应新的寄主和生存环境[1]。在自然选择下，有益变异得到积累，有害变异则被淘汰。由于寄主和病原物本身是由复杂的、动态结构的个体组成的，随着病原物群体结构的时空变化，这种特定的寄主-病原物关系也随之发生改变，因此，研究病原物的分子变异及群体遗传结构对认识病害的流行、有效选育和使用抗性品种乃至病害的控制都具有重要的理论和实践意义。

水稻条纹病毒(Ricestripevirus，RSV)是纤细病毒属(Tenuivirus)的典型成员之一，引起的水稻条纹叶枯病是水稻上一种重要的病毒病，该病最早在日本发生，后在朝鲜、乌克兰和中国均有发生[2-3]，近年来在越南也有发现[4]。历史上该病在各地区曾多次暴发流行，给水稻生产造成了严重损失[5-6]。病原的变异是其流行的主要原因之一，因此在已对RSV-cp和sp遗传多样性研究的基础上[7-8]，进一步对RSV其他2个承担着不同功能的基因(NS2和NS3)分子变异进行分析，明确与其他两个基因分子变异的异同及其独特的分子变异特征，将为RSV的起源进化与流行规律研究提供科学依据，从而达到控制病害的目的。

RSV是负义单链RNA(-ssRNA)病毒，其基因组由4条RNA组成，除RNA1采用负义编码策略外，其余3条均采用双义编码策略，共编码7个蛋白[9]。有研究表明RSV-NS2蛋白可参与病毒的胞间运动[10]，并与水稻的基因沉默抑制子3(SGS3)互作，证明其为RSV编码的一个沉默抑制子[11]；Xiong等证实RSV-NS3蛋白是基因沉默抑制子而非致病性决定因子[12]。RSV中不同的基因承担不同的功能，其所受的选择压也不相同，导致其变异的范围和程度亦不相似，作为起沉默抑制作用的2个基因在病毒的流行进化中分子变异有何规律，其变异与RSV中其他功能基因的变异有何异同都是值得我们深入探讨的科学问题。因此本研究从水稻条纹叶枯病田间流行危害中的重要寄主-灰飞虱出发，将其作为昆虫病毒，分析其中承担不同功能的2个基因(NS2和NS3)的分子变异特征，以揭示该病毒的群体遗传结构及其分子变异规律，为该病害的流行监测和生态控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

病毒分离物：2003-2005采集来自云南大理、保山，河北唐海，山东济宁，江苏高邮、洪泽、丹阳、盐都、靖江、海安、沛县的秧田或稻田灰飞虱，采用单雌产卵法进行毒源纯化得到21个纯分离物(表1)，保存备用。具体纯化方法如下：灰飞虱饲养至成虫，单头雌虫产卵3～4 d，Dot-ELISA检测[13]，阳性虫后代饲养2～4代后再同上法纯化一次，所得纯系扩繁后用于实验。

表1 本研究中RSV分离物的来源、采集时间及序列登录号

表2 进化树构建所引用的RSV分离物

续表2 Continued table 2

序号SN分离物Isolate来源及采集时间Source，collectionyearNS2登录号AccessionnumberofNS2NS3登录号AccessionnumberofNS342JSHZ03江苏洪泽，2003AY597399AJ62031443JSHA03江苏淮安，2003AY28485244JSDF01江苏大丰，2001AY28493145JSSZ10江苏苏州，2010JQ927431JQ92742546HuZ10浙江湖州，2010JQ927427JQ92742147ZJ02浙江杭州，2002AY28484748ZJ01浙江杭州，2001AY28494149AHFX09安徽肥西，2009FN65079350AHMAS09安徽马鞍山，2009FN65079651AHSX09安徽寿县，2009FN65079852LN08辽宁，2008JQ927430JQ92742453LNDW02辽宁大洼，2002AF509500

主要试剂：提取RNA的Trizol试剂来自Invitrogen公司，用于cDNA合成的M-MuLV反转录酶、RNasin RNA来自MBI公司，Taqplus DNA聚合酶、dNTP等PCR试剂均购自上海申能博采有限公司。其余试剂为国产分析纯。

主要仪器：Eppendorf BioPhotometer Plus 核酸蛋白测定仪，艾本德(上海) 国际贸易有限公司；电泳仪和水平电泳槽，北京六一仪器厂；Bio-Rad MyCyclerTM PCR 仪，南京润亚生物科技发展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 灰飞虱总RNA提取 取带毒灰飞虱10头，冰浴条件下迅速彻底匀浆，然后用TRIZOL试剂盒按产品说明书提取灰飞虱总RNA。

1.2.2 RT-PCR 根据已报道的RSV日本T分离物RNA2、RNA3的基因序列，设计2对用于扩增RSV-NS2和RSV-NS3基因的寡聚核苷酸引物，并由上海英俊生物技术公司合成，引物序列如表3。

反转录程序如下：取总RNA 3 μl，3′端引物(10 pmol/L)1 μl，ddH2O 6 μl，70 ℃下变性5 min，冰浴1 min，再依次加入下列试剂，5×M-MuLV反转录酶缓冲液2 μl、dNTP 0.5 μl(10 mmol/L)、RNasin(40 U/μl)0.5 μl、M-MuLV反转录酶(20 U/μl)0.5 μl、ddH2O 1.5 μl。42 ℃水浴1 h，70 ℃灭活10 min，-20 ℃保存备用。

PCR扩增在25 μl反应体系中进行，包括反转录产物3 μl，5′端和3′端引物(10 pmol/μl)各1 μl、dNTP(10 mmol/L)0.5 μl、10×buffer 4 μl、ddH2O 15 μl、Taqplus DNA聚合酶(4 U/μl)0.5 μl。扩增条件：94 ℃变性2 min后，94 ℃变性1 min，53 ℃退火2 min，72 ℃延伸1.5 min，共30个循环，最后一个循环结束后，72 ℃保温10 min。

1.2.3 克隆及测序 PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳后用柱式胶回收试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)回收，最后溶于30 μl 的溶解液中。回收产物与pMD18-T载体连接(参见pMD18-T试剂盒说明书)，连接产物转化大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞，碱裂解法提取质粒，经PCR及酶切鉴定筛选重组质粒。每个分离物挑选2个阳性克隆进行测序，测序由上海生工生物工程技术服务有限公司采用双脱氧核苷酸终止法在ABI 3730 DNA自动测序仪上进行。

表3 扩增RSV-NS2和NS3基因的特异引物

注：“GGATCCC”表示BamHⅠ酶切位点；“GTCGAC”表示SalⅠ酶切位点。

1.2.4 序列分析 在GeneBank中利用Blast搜索(网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) RSV已发表日本、韩国及全国各地分离物(表 2) 进行比较分析。序列同源性用DNASTAR 5.0 软件完成。序列间相似性比对用Clustal W分析完成(Thompson et al., 1994)，采用Mega 4.0软件中的邻近法则(Neighbor-Ioining，NJ)(Swofford, 2002)，Kimura 2-参数模型(Kumar et al., 2001)构建系统进化树，Distance计算遗传距离，Pamilo-Bianchi-Li 估算基因的选择压。

2 结果与分析

2.1 NS2和NS3基因的扩增和序列分析

20个灰飞虱来源的RSV分离物RNA经RT-PCR扩增后，均可得到长度为650 bp(NS2)和700 bp(NS3)左右的扩增片段，与预期目的片段大小相符。PCR产物克隆测序，结果表明20个RSV分离物的NS2基因均由600 nts组成，编码199个氨基酸；NS3基因均由636 nts组成，编码212个氨基酸(Genbank登录号见表1)。应用DNASTAR软件将本研究中的20个RSV分离物的NS2和NS3基因的核苷酸序列和推导编码的蛋白氨基酸序列同源性进行比较分析，各分离物间核苷酸序列同源性为96.5 %～100 %(NS2)和95.4 %～100 %(NS3)，推导的氨基酸序列同源性为97.0 %～100 %(NS2)和96.2 %～100 %(NS3)。

2.2 基于NS2和NS3基因核苷酸序列构建的系统发育树

根据水稻条纹叶枯病的发生及分布状况选取已发表的包括日本、韩国及中国各地的RSV分离物(表 2)，以国家、地名首字母、采集年份命名，与本试验中20个灰飞虱来源的RSV分离物一起依据NS2和NS3基因核苷酸序列利用Mega 4.0中的NJ法，Kimura 2-参数模型构建系统发育树(图 1-A、B)。从系统发育树可以看出，20个分离物的NS2和NS3基因都可以明显分为2组，其中一组均为中国云南水稻上的RSV分离物，这与魏太云等[12]的研究结论基本相似，2组间遗传距离分别为0.05711和0.06081(表4)，NS3的遗传距离大于NS2。

就NS2而言，在组I中又可以分成IA和IB 2个亚组，IB组中为灰飞虱携带的云南2个分离物，IA组除CHN-YNYX03、CHN-YNDL01和CHN-YNDL03外包括中国其他地区、日本、韩国等地水稻上以及本实验中灰飞虱携带的RSV分离物，2个亚组之间的遗传距离为0.02918(表4)。NS3组I也可以分成IA和IB2个亚组，IB组中为日本水稻上的2个分离物，IA组除CHN-YNBS04、CHN-YNKM02外包括中国其他地区和韩国水稻上以及本实验中灰飞虱携带的RSV分离物，2个亚组之间的遗传距离为0.02918(表4)。纵观2图，组IA中都包括了日本、韩国与中国沿海及黄淮地区的水稻及灰飞虱上的分离物，这与国外学者Sakai 等[14]和 Jonson等[15]的研究结论基本相似，认为三地的灰飞虱存在迁飞的可能性，推测RSV可能为同一起源。进一步细分，2图中星号部分均为灰飞虱来源的分离物，与水稻来源的分离物遗传距离较大，说明其遗传多样性与寄主具有一定的相关性。

表4 NS2和NS3基因组内和组间的遗传距离

注：组型分配基于图1的系统进化分析。

Note： Subtypes are designated based on the phylogenetic analyses of RSV in Fig 1.

表5 NS2和NS3基因的Z-test 检测

注:dn和ds分别指发生非同义/同义替换的频率，是衡量选择压的重要参数(dn>ds：正向选择压；dnds: positive selection; dn

利用Mega 4.0中的Pamilo-Bianchi-Li法估算RSV-NS2和NS3 基因的进化限制系数(表5)，由表可知Z-test为选择压的检测方法之一，当P_Value<0.01时该模型显著，可以接受对应的假说，2个基因的dn

分枝上的数值代表自展支持率，小于50 %的分枝去除，黑色加强线与分组“IA, IB, II”对应Numerical values at each node indicate the bootstrap support ( as a percentage ). Branches with a bootstrap support of less than 50 % are merged. The underlines are corresponding to subtype‘IA, IB, II’图1 基于本研究20个及引用的RSV分离物NS2(A)和NS3(B)基因核苷酸序列构建的系统发育树 Fig.1 Phylogenetic tree constructed from alignment of nucleotide sequences of the NS2(A) and NS3(B) genes of 20 RSV isolates from this study and Genbank

2.3 NS2和NS3基因氨基酸序列变异特征

以NS2和NS3基因氨基酸序列为基础，采用邻近结合法构建的系统发育树显示，2个基因氨基酸都与各自核苷酸发育树的分组基本相似，中国云南水稻上RSV分离物独立成组，中国沿海和黄淮地区及日本、韩国等地的RSV分离物又归为一组。

方框中横向氨基酸序列对应左边RSV分离物，方框上方数字表示氨基酸在序列中所处位置(图3同)Aligned, abbreviated amino acid residues in the box correspond to the left-sided RSVs. Numbers above the box indicate the numerical order of the amino acid sequences of the nucleocapsid protein (as in Fig.3 )图2 65个RSV分离物NS2基因氨基酸序列同源性构建的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree constructed from alignment of amino acids sequences of the NS2

图3 63个RSV分离物NS3基因氨基酸序列同源性构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree constructed from alignment of amino acids sequences of the NS3 gene of 63 RSV isolates

NS2基因由199个氨基酸组成，序列上共有35处变异，变异较大的有7处(图 2)。Ⅰ组中有2处变异，在第177位上来自本研究灰飞虱携带的8个分离物及1个韩国水稻上的分离物均具有亲水性的苏氨酸，在系统进化树上聚在一小簇，而其他分离物均具有疏水性的丙氨酸，由此可见此变异与寄主具有一定的相关性；在185位上除韩国水稻上的分离物KR-GSJB07外其余所有韩国分离物及部分中国分离物在此位点为谷氨酸，而除中国云南水稻上的分离物CHN-YNLL04为中性的天冬酰胺外，其余分离物均为酸性的天冬氨酸。Ⅱ组中有5处变异，由图2可见，此组均为中国云南水稻上的分离物，在氨基酸序列上较之Ⅰ组有较大变异，除处在第12位的CHN-YNBS07(R，精氨酸)、第181位的CHN-YNLQ04和CHN-YNBS07(A，丙氨酸)、第183位的CHN-YNDL08(F，苯丙氨酸)有变异外，其余该组分离物与Ⅰ组分离物在此5个位点上均有一致变异。由此可见，NS2氨基酸分子变异首先与寄主相关，从寄主角度可以划分为灰飞虱和水稻2个寄主群；其次与地缘相关，可以分成中国云南及云南以外的2个地理亚群。

NS3基因由212个氨基酸组成，序列上有41处变异，变异较大的有5处(图 3)。Ⅰ组中有3处变异，分别为第93、97、175位的4个中国水稻、灰飞虱分离物及1个韩国水稻分离物的变异，其余分离物均为一致的氨基酸序列，为同义碱基置换。与此相反，Ⅱ组有5处变异，仍均为中国云南水稻上的分离物，除第93位的CHN-YNDL08和CHN-YNKM08(Y，酪氨酸)外，5个位点具一致的变异，分别由Ⅰ组的天冬氨酸(D)、酪氨酸(Y)、苏氨酸(T)、精氨酸(R)和谷氨酸(E)变为谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、丙氨酸(A)、赖氨酸(K)和甘氨酸(G)。由以上分析可知，NS3氨基酸分子变异除中国云南水稻上的分离物具一致变异这一特征外，其余分离物的变异无明显的规律性可循。因此从功能上分析，其分子变异与地域相关。

3 讨 论

RSV属于RNA病毒，这种病毒由于其依赖于RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRP)或复制酶缺乏校正功能，从而导致RNA基因组复制过程中易发生错配，据估计RNA病毒的突变率约为每个复制循环10-4个核苷酸[16]。因RNA复制酶的这一特性，许多RNA病毒呈现丰富的遗传多样性，以至于用“准种(quasispecies)”来描述RNA病毒的特征，即单个病毒分离物不是由单个序列组成而是由一种优势序列和一些低频率与优势序列差异微小的序列群组成[17]。病毒的重要生物学特性如适应性和寄主范围可能与准种变异水平有关，Schneider等[18]利用TMV、CMV和CCMV这3种具有共同进化联系的病毒侵染同种寄主植物后分析其准种变异水平，发现准种变异水平与其寄主范围相对应，寄主范围最广的CMV准种变异水平最高，其高度的多样性可以使其较易适应新的选择压力进入新的生境，造成更大的危害。本研究分析了灰飞虱携带的20个RSV分离物与水稻上分离物的NS2和NS3基因的分子变异特征及系统进化关系，发现2个基因的遗传结构均与地缘和寄主(水稻和灰飞虱)相关，结合灰飞虱携带RSV的cp和sp基因的研究结果，进一步暗示了RSV可能符合病毒准种的遗传结构特征。

这一结果与魏太云等[19-20]的研究结果基本一致，认为RSV自然种群遗传结构符合准种结构特征分布，各基因遗传多样性值上略有差异，与之编码的功能蛋白在植物寄主及介体昆虫互作过程中所受的负选择压力有关。植物病毒的进化机制研究表明奠基者效应、选择(正、负)、互补为植物病毒种群遗传结构的主要变异机制[21]，其中负选择主要是在维持病毒与寄主植物或介体昆虫的有效互作中起作用，本研究对RSV-NS2和NS3基因的进化限制系数进行测定，选择Z-test作为选择压的检测方法，结果2个基因的dn

基于2基因核苷酸和氨基酸序列构建的系统进化树都显示了中国云南水稻上RSV分离物独立成组，并且在分子变异热点的分析上云南独立组的氨基酸变异规律也较为一致，表明RSV-NS2和NS3的在遗传进化中出现了一定的地理隔离，这也是病毒变异的主要动力之一，究其原因可能与云南独特的生态环境和丰富的生物多样性相关，云南大部分是山区，地理隔离比较明显，不同地区特别是高山相隔地区间的灰飞虱很难相互交配，于是造成了其所处地区独立的遗传结构，故RSV在与植物寄主长期的互作关系中形成了具有云南特色的组群。但同时发现灰飞虱携带的云南地区的RSV分离物与云南大部分水稻上分离物处于不同的组群，说明云南地区的RSV种群遗传结构比较复杂，这与云南地区稻作栽培历史悠久、水稻品种多、各地栽培制度和品种布局各异，加上生境变化异常、地理气候多变等因素有关。另外中国沿海及黄淮地区与日本、韩国等地灰飞虱和水稻上分离物位于同一组群，说明三地RSV存在着一定的交流，侧面验证了灰飞虱远距离迁飞的可能性。早在1774年Hirao等[22]就发现我国东海上存在着灰飞虱，并且这些灰飞虱随着每年夏季的东南风远距离迁飞到日本的西南地区；2011年日本学者酒井淳一对日本九州和中国东部地区RSV的N、NCP、IR3和IR4系统发育树与氨基酸变异热点分析结果表明日本九州RSV遗传结构与中国东部地区的相似，推测其可能是同一起源；韩国地区RSV暴发时间与日本及我国江、浙、沪一带的暴发时间也相当吻合[23]，预测三地RSV具有共同的起源，从病害流行的时间和地点看，我国的RSV更可能起源于日本。

本研究结果还显示同一地理种群的灰飞虱携带的RSV分离物与水稻上分离物处于不同的亚组群，表明其分子变异还与寄主相关。有研究表明植物虫传病毒的种群遗传多样性在很大程度上受需要维持病毒与介体昆虫间特异性互作所限制[24]，RSV既是植物病毒又是昆虫病毒，在水稻和灰飞虱2种不同类型的寄主中，由RNA2和3编码的NS2和NS3蛋白在病毒传播过程中功能不尽相同，因此推测它的遗传多样性的分布至少在功能的角度(氨基酸序列)必然与寄主相关，本实验的结果也验证了这一点。另核苷酸序列的变异多数为无义突变，2基因的变异都较小，说明其爆发流行中的决定因素并不在于RSV变异，而主要取决于与病原本身无关的介体或环境等因素，因此若要深入地研究病毒的灾变规律，还需系统地调查病毒病害和介体昆虫的发生规律以及发生地的种植结构和地理气候等因素。本室多年来的研究(结果另文发表)显示2000年以来在以江苏为中心的中国沿海地区RSV的爆发流行可能除了品种这一基本要素外，主要是由环境因素引起的，在这一阶段的农田生态系统中出现了适应灰飞虱发生和RSV传播的有利因素从而导致了RSV的流行，其中灰飞虱带毒率与病情严重度呈不同程度的相关，表明其为该病害流行的一个关键因子。因此在水稻条纹叶枯病的控制方面，应从环境因素考虑找到反映病害流行的自然关键因子，明确病害流行的自然成因，从而采取适当的应对措施，此才是控制其危害的根本。

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(责任编辑 李山云)

Molecular Variality ofNS2 andNS3 Genes from Rice Stripe Virus inLaodelphaxstriatellus

REN Chun-mei, CHENG Zhao-bang*, YANG Liu, MIAO Qian, ZHOU Yi-jun

(Institute of Plant Protection, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Jiangsu Nanjing 210014, China)

In order to reveal the molecular variation characteristics ofNS2 andNS3 genes from rice stripe virus (RSV) in the small brown planthopper (SBPH,LaodelphaxstriatellusFallén), we collected twenty SBPH isofemale lines with RSV from Jiangsu, Yunnan, Shandong, Hebei province, China. The specific fragments ofNS2 andNS3 genes were amplified by RT-PCR, then were cloned and sequenced. Bioinformatics software was used to analyze the molecular variation characteristics and phylogenetic relationship of RSV isolates from different hosts and regions combining with other isolates sequences reported in Genbank. Sequence determination showed that the identities ofNS2 andNS3 genes nucleotide and amino acid sequences among the 20 isolates ranged from 96.5 % to 100 % (NS2) and 95.4 % to 100 % (NS3), 97.0 % to 100 % (NS2) and 96.2 % to 100 % (NS3). The analysis of phylogenetic tree constructed on nucleotide sequence showed that two genes were obviously divided into two groups, one group included all the rice isolates of Yunnan in China, genetic distance between the two groups were 0.05711 (NS2) and 0.06081 (NS3), the results of Z-test showed that the two genes were under the pressure of strong negative selection. Analysis of phylogenetic tree and variation hotspot constructed onNS2 andNS3 amino acid sequences, molecular variation of RSV was strongly associated with its geographical origin, two genes could be grouped into two geographical populations, i.e. Yunnan in China and the restswithout Yunnan in China; secondly associated with its host origin, two genes could be grouped into SBPH and rice populations.

Rice stripe virus;NS2 andNS3 genes; Molecular valiality; Hosts colony; Geographical colony

1001-4829(2016)08-1854-10

10.16213/j.cnki.scjas.2016.08.018

2015-10-09

国家自然科学基金(31201506)；国家公益性(农业)行业专项(201003031)；江苏省农业科技自主创新项目[CX(13)5026]

任春梅(1981-)，女，副研究员，主要从事植物病毒方面的研究，E-mail:renjie_rcm@126.com,*为通讯作者: E-mail: onlyone8501@126.com。

S432.45

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