2011—2015年我国南方地区PEDV分子流行病学调查及S基因遗传变异分析

李智丽，黄淑坚，马静云，毕英佐

（1.佛山科学技术学院生命科学与工程学院，广东 佛山 528000；2.华南农业大学动物科学学院，广东 广州 510642）

2011—2015年我国南方地区PEDV分子流行病学调查及S基因遗传变异分析

李智丽1，黄淑坚1，马静云2，毕英佐2

（1.佛山科学技术学院生命科学与工程学院，广东 佛山 528000；2.华南农业大学动物科学学院，广东 广州 510642）

应用RT-PCR方法对南方地区五省（广东、广西、福建、四川、江苏）18个猪场7日龄以内发病仔猪的小肠组织和粪便样本进行猪流行性腹泻病毒（PEDV）检测，对9个猪场进行为期5年的动态监控，并对2011—2015年期间分离的35个PEDV流行株的S基因进行测序，与GenBank中的PEDV参考序列进行比较，并绘制了系统进化树。结果显示，上述地区五省存在Group1和 Group 2两种类型毒株。Group1与美国、韩国毒株较为接近，可分为G1-1、G1-2、G1-3 和G1-4等4个亚群，Group 2与2004年国内分离毒株较为接近，可分为G2-1、G2-2两个亚群。25个中国南方地区毒株集中于 G1-2 和 G1-3，而另外8株与2004年国内毒株（JS-2004-2）同属G2-2亚群。不同类型的毒株引发的PEDV临床表现及死亡率不同，G2-2亚群的毒株引发的PED相对缓和，死亡率较低且病程较短，而位于G1-2和G1-3亚群（尤其是G1-3）的毒株则引起大规模急性暴发，病程较长，死亡率较高。

猪流行性腹泻病毒；动态监控；S基因；遗传变异

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的以腹泻、呕吐、脱水及哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病［1］。PED 于1971年首次报道，并于1978年从患病猪的病料中分离出该病病原［2-3］。该病主要发生于欧洲养猪国家和东南亚养猪国家［4-5］。2008年有报道PEDV 在我国免疫猪群中流行［6］。2010年10月我国暴发PED疫情，发病范围广，呈急性发生，发病率为80%～100%，死亡率在50%以上［7-9］。截至目前，PEDV在中国、韩国、美国、越南、泰国、匈牙利、台湾、加拿大、法国、美国等多个国家和地区均有报道［10-17］，PEDV给全球养猪业造成严重的经济损失。

PEDV属于尼多病毒目（Nidovirales）冠状病毒科（Coronviridae）冠状病毒属（Coronavims）成员。该病毒呈多形性，病毒颗粒直径约95～190 nm，平均直径（包括纤突）约为130 nm，表面有囊膜，囊膜上有花瓣状纤突，长约18～23 nm［18-19］。PEDV是有囊膜、不分节段的单股正链RNA病毒，其基因组大小约为28 kb，5'端为含有帽子结构的非翻译区（untranslated region，UTR），3'端为含有多聚腺苷酸尾巴（poly A）的非翻译区，全基因组编码至少7个开放阅读框（open reading frames，ORFs），相邻基因之间存在间隔序列［19-21］。S基因、E基因、M基因和N基因分别编码病毒的结构蛋白［20-21］。其中，S 基因编码S（spike）蛋白，由1 383个氨基酸组成，分子质量为180～220 ku，是位于病毒粒子表面的纤突糖蛋白，在病毒粒子与细胞表面受体结合后通过膜融合侵入宿主细胞，在感染宿主体内介导中和抗体产生的过程中发挥重要生物学作用［22-24］。研究表明，S基因在分析PEDV流行性毒株的遗传变异中发挥重要作用，是序列比对中所用的重要基因［5，25］。PEDV S基因的1 495～1 914 bp含有主要的中和介导抗原决定部位，称为COE片段，而COE片段存在大量抗原决定簇，是作为重组载体较为重要的基因，核苷酸全长为420 bp，编码140个氨基酸，在这个序列区内所发生的点突变可能会使相关的单克隆抗体失效［26-28］。

本研究对我国南方地区五省（广东、广西、福建、四川、江苏）18个猪场7日龄以内发病仔猪的小肠组织和粪便样本进行PEDV检测，对9 个暴发PEDV的猪场感染情况进行深入调查，积累了大量的流行病学材料。对此次疫情的暴发特征、病毒排毒规律及不同猪群发病规律进行分析，并对2011—2015年期间分离的35个PEDV流行株的S基因进行测序，同时对COE片段进行生物信息学分析，构建系统进化树将S基因与GenBank中的PEDV参考序列进行分析比较，为探讨当前我国PED发生规律以及制定有效防控措施提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病料采集与处理

采集我国南方地区五省（广东、广西、福建、四川、江苏）18个猪场7日龄以内发病仔猪的小肠组织和粪便样本，并挑选9个规模化猪场进行现场监控，记录2011年1月—2015年6月的发病率、死亡率及临床症状。取肠道组织或粪便组织置于预冷的无菌研磨器中，加入3 mL DMEM（含400 U/mL青霉素、200 μg/mL链霉素），反复研磨至糊状，然后置于-80℃冰箱中迅速冷冻，再迅速置于37℃温水中融化，如此反复冻融3次，10 000 g离心20 min，上清液用孔径0.22 μm的滤器过滤除菌，粪便样品加入1 mL DMEM直接震荡5 min，10 000 g离心5 min，取上清液用于RT-PCR检测。

1.2 主要试剂

RNA提取试剂、PrimeScript One Step RTPCR Kit Ver.2、Trizol Reagent、Ex Taq、dNTP Mixture、pMD19-T Vector、dNTPs（2.5 mmol/L）、DL2000™ DNA Marker和6×Loading Buffer均购自广州瑞真生物技术有限公司（TaKaRa公司）。DH5α大肠杆菌感受态细胞自制。

1.3 引物设计及合成

参照GenBank中的PEDV毒株CV777株和Brl/87株基因序列的S基因序列，针对基因保守区利用Oligo 7.0设计引物（表1），引物由上海生工生物工程有限公司合成，扩增的目的片段大小约4 200 bp。

表1 引物名称、序列及长度

1.4 S基因扩增

病毒RNA提取按照实验室分子生物学常规操作进行。然后参照PrimeScript® One Step RTPCR Kit Ver.2产品说明书配制RT-PCR反应液，反应程序如下：50℃反转录30 min；94℃ 预变性5 min；94℃变性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸90 s，30个循环，RT-PCR产物直接用于1%琼脂糖凝胶电泳检测和回收。参照Omega公司的胶纯化试剂盒说明书对RT-PCR产物进行回收与纯化；将回收产物按照10 µL连接反应体系于4℃下连接过夜，将连接产物5 µL转化感受态细胞50 µL，于37℃下培养过夜。对平板中的阳性菌落进行筛选、鉴定，选择经PCR鉴定为阳性的重组质粒，送北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行序列测定。

1.5 S基因的生物信息学分析

应用DNAStar、CLUSTALX v1.83比对，采用MegAlign software（MEGA，version5.0）基因序列软件的 Clustal W计算方法进行序列分析，采用常用的临位相接法（Neighbor-joining法）进行系统进化树的构建并以Bootstrap验证进化树的可信度，分别对35株流行毒株S基因进行测定，并与GenBank中调出的参考序列（表2）进行比对，分析彼此间的相似性、遗传进化关系及变异程度，并绘制系统进化树。通过网站 http：//tools.immuneepitope.org 对S蛋白中的COE片段进行抗原位点预测；通过网站 http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/ 对COE片段进行糖基化位点预测。

2 结果与分析

2.1 PEDV感染猪场的临床表现

对9个猪场的监控结果可知，PEDV全年均有发生（图1），但仔猪的死亡率有所差异，2011—2012年死亡率为50%～100% ，2013年的死亡率最低，2014—2015年则有增加趋势，死亡率为0～30%，死亡率最高发生在2011年2月，9个猪场仔猪死亡数量达到12 000头。PEDV对怀孕母猪的影响较大而对育肥猪的影响最小，其中，怀孕母猪、哺乳母猪、保育猪和育肥猪的发病率为20%～80%，临床表现为沮丧、食欲不振、腹泻等，死亡率较低甚至没有死亡（图2）。

图1 2011—2015年9个规模化猪场仔猪死亡情况

表 2 本研究所用序列及参考序列信息

图2 2011年9个规模化猪场怀孕母猪、哺乳母猪、保育猪和育肥猪的发病情况

2.2 S基因变异分析

将35株临床分离的PEDV的S基因测序结果上传至GenBank，其S基因序列长度为4 152～4 161 bp，编码 1 384～1 387个氨基酸，其中有4个毒株（CH-SHT-12- 2011、CH-STC-12-2012、CH-HKC-08-2011、CHGMB-02-2013）与疫苗株CV777相比有独特的结构特征，在163位有1个氨基酸（N）插入，并有 58 个氨基酸变异，变异率为 4.18%；而另外的31株流行株在59～62位有4个氨基酸（QGVN），在140位有1个氨基酸（N）插入，96个氨基酸变异，变异率为6.92%。这些变异情况与美国毒株（PC21A、IA1、MEX-104-2013和USA-Colorado30-2013）和台湾毒株（TWChiayi-32）一致，并且与韩国在2011年分离的流行株（CNU-091222-01 和 CNU-091222-02）的变异情况一致。

与经典毒株CV777（疫苗株）相比，流行株的COE片段核苷酸变化最大的位置位于1 586～1 617 bp和1 802～1 874 bp（氨基酸位置分别是527～539和600～625）。在PEDV流行毒株的COE片段序列中存在4个B细胞抗原表位区，分别为其推导氨基酸序列中第4～10位的PSFNDHS，第55～69位的NVTNSYGYVSKSQDS，第76～83位的QSVNDYLS以及第129～134位的GTPKP（图3）。COE片段氨基酸序列的糖基化位点预测位于COE推导氨基酸序列的第13位与第55位，即S蛋白中的第511位与第533位中均存在两个高度保守的糖基化位点，分别为NIT与NVT（图4）。

图3 COE片段B细胞抗原表位预测

图4 S基因COE片段糖基化位点的预测

2.3 S基因遗传进化分析

构建S基因遗传进化树，结果（图5）表明，PEDV存在两种类型毒株，分别为Group1和Group 2。Group1与美国、韩国毒株较为接近，可分为4个亚群G1-1、G1-2、G1-3 和G1-4；G1-1亚群包含7个美国流行毒株、5个台湾流行毒株和2个中国南方地区毒株，G1-2亚群包括15个南方地区毒株，4个国内毒株及两个美国毒株，G1-3亚群包括10个南方地区毒株和2个国内毒株，G1-4亚群包括1个韩国毒株和1个中国毒株。可见，G1-2亚群包含的毒株大部分是2012—2015年分离的，而G1-3 亚群则主要包含了2011年国内分离的毒株。Group 2与2004年分离的毒株较为接近，可分为G2-1、G2-2两个亚群。其中G2-1亚群主要包含早期毒株及疫苗株，而G2-2亚群则包含了2004年国内毒株（JS-2004-2）和8株南方地区流行株。

图5 35株中国南方地区PEDV毒株及参考序列的S基因遗传进化树

2.4 S基因同源性分析

35株临床分离的PEDV的S基因之间同源性为93.0%～100%，与参考序列的同源性为92.4%～99.0%； Group1的序列之间同源性为97.5%～100%，与Group2相比同源性为93.7%～95.9%；G2-2亚群中的8个毒株与2004年国内毒株（JS-2004-2）同源性较高，而与其余27个南方地区毒株（位于G1-2和G1-3亚群）相比同源性较低、为94.8%～95.7%；G1-2和G1-2亚群的序列同源性为97.9%～98.7%。

值得关注的是，不同类型的毒株引发的PEDV临床表现及死亡率不同，G2-2亚群的毒株引发的PED相对缓和，死亡率较低且病程较短，而位于G1-2和G1-3亚群（尤其是G1-3）的毒株则引起大规模急性暴发，病程较长，死亡率较高。

3 结论与讨论

本研究对南方五省18个猪场7日龄以内发病仔猪的小肠和粪便样本进行了PEDV检测，对其中9个猪场进行为期5年的动态监控。结果发现PED全年均有发生，有一定规律性，但仍不明显。 2011—2012年死亡率为50%～100%，而2014—2015年死亡率为0～30%，2013年的死亡率最低，而2014—2015年有增加趋势。PEDV对怀孕母猪的影响较大而对育肥猪的影响最小，建议开展各阶段尤其是怀孕母猪体内的PEDV抗体监控，进而为PEDV的防控提供科学指导。国外学者也认为应当采取科学措施合理管理怀孕母猪以便减少仔猪的发病率和死亡率［20］。

本研究对2011—2015年期间分离的35个PEDV流行株的S基因进行测序，其中有4个毒株（CH-SHT-12- 2011、CH-STC-12-2012、CH-HKC-08-2011 和 CH-GMB-02-2013）与疫苗株CV777相比有独特的特征，变异率为4.18%，而另外的31株流行株变异率为6.92%，且这些变异情况与美国毒株（PC21A、IA1、MEX-104-2013 和USA-Colorado30-2013）、台湾毒株（TW-Chiayi-32）及韩国在2011年分离的流行株（CNU-091222-01 和CNU-091222-02）一致［5，11，15，17，29-30］。

通过构建S基因遗传进化树发现，PEDV存在两种类型毒株，分别为Group1和 Group 2，其中31株流行株归于Group1，与美国、韩国毒株同源关系较为接近，具有同源性意义；CH-SHT-12-2011、CH-STC-12-2012、CHHKC-08-2011和 CH-GMB-02-2013归于Group 2，与2004年分离毒株同源关系较为接近。且两种类型的毒株引发的PEDV临床病死率不同，Group1的毒株引起的PEDV呈大规模急性暴发，病程较长，死亡率较高；Group 2的毒株引发的PEDV呈缓和型暴发，死亡率相对较低且病程较短。可见本研究中31株毒株为世界范围内流行株，而其余4个毒株呈地方性流行，与早期分离毒株较为接近。

我国南方地区PEDV流行毒株S蛋白中的第511位与533位中均存在两个高度保守的糖基化位点，分别为NIT与NVT，与文献报道一致［31］。糖基化是影响抗原的免疫原性、诱导动物机体产生保护性免疫反应的一个重要原因。对我国南方地区PEDV流行毒株COE片段B细胞抗原表位预测发现，与Chinju99株存在差异，南方地区毒株的COE片段仅有4个B细胞抗原表位区，有别于Chinju99的6个B细胞抗原表位区［26，32］。这些突变位点是否能引起毒株毒力改变仍需要进一步研究。

本研究结果揭示我国主要流行的PEDV野毒株不同于疫苗株（DRl3、CV777），可逃避目前国内外传统的常规疫苗免疫，但我国同时又存在经典毒株，使得我国PEDV野毒株遗传变异的复杂性更大［8-9，22-23］，加剧了临床防控的难度。因此对PEDV的长期监控及抗体检测需加强，并从发病原因、病原变异规律、免疫方式上进一步深入研究。

［1］Song D，Park B. Porcine epidemic diarrhoea virus：a comprehensive review of molecular epidemiology，diagnosis，and vaccines［J］. VirusGenes，2012，44（2）：167-175.

［2］Pensaert M B，de Bouck P. A new coronaviruslike particle associated with diarrhea in swine［J］. Arch Virol，1978，58（3）：243-247.

［3］Debouck P，Pensaert M. Experimental infection of pigs with a new porcine enteric coronavirus，CV777［J］. Am J Vet Res，1980，41（2）：219-223.

［4］Rodak L，Valicek L，Smid B，et al. An ELISA optimized for porcine epidemic diarrhoea virus detection in faeces［J］. Vet Microbiol，2005，105（1）：9-17.

［5］Park S J，Moon H J，Yang J S，et al. Sequence analysis of the partial spike glycoprotein gene of porcine epidemic diarrhea viruses isolated in Korea［J］. Virus Genes，2007，35（2）：321-332.

［6］Chen J F，Sun D B，Wang C B，et al. Molecular characterization and phylogenetic analysis of membrane protein genes of porcine epidemic diarrhea virus isolates in China［J］. Virus Genes，2008，36（2）：355-364.

［7］Sun R Q，Cai R J，Chen Y Q，et al. Outbreak of porcine epidemic diarrhea in suckling piglets，China［J］. Emerg Infect Dis，2012，18（1）：161-163.

［8］Chen F，Pan Y，Zhang X，et al. Complete genome sequence of a variant porcine epidemic diarrhea virus strain isolated in China［J］. J Virol，2012，86（22）：12448.

［9］Wang J，Zhao P，Guo L，et al. Porcine epidemic diarrhea virus variants with high pathogenicity，China［J］. Emerg Infect Dis，2013，19（2）：2048-2049.

［10］Stevenson G W，Hoang H，Schwartz K J，et al. Emergence of porcine epidemic diarrhea virus in the United States：Clinical signs，lesions，and viral genomic sequences［J］. J Vet Diagn Invest，2013，25（2）：649-654.

［11］Scott A，McCluskey B，Brown-Reid M，et al. Porcine epidemic diarrhea virus introduction into the United States：Root cause investigation［J］. Prev Vet Med，2015，123：192-201.

［12］Ojkic D，Hazlett M，Fairles J，et al. The first case of porcine epidemic diarrhea in canada［J］. Can Vet J，2015，56（2）：149-152.

［13］Lee C. Porcine epidemic diarrhea virus：An emerging and re-emerging epizootic swine virus［J］. Virol J，2015，22：12：193.

［14］Opriessnig T. Re-emergence of porcine epidemic diarrhea virus in the global pig population［J］. Vet J，2015，204（2）：131.

［15］Sun M，Ma J，Wang Y，et al. Genomic and epidemiological characteristics provide new insights into the phylogeographical and spatiotemporal spread of porcine epidemic diarrhea virus in Asia［J］. J Clin Microbiol，2015，53（5）：1484-1492.

［16］Vui D T，Tung N，Inui K，et al. Complete genome sequence of porcine epidemic diarrhea virus in vietnam［J］. Genome Announc，2015，160（8）：1931-1938.

［17］Alvarez J，Goede D，Morrison R，et al. Spatial and temporal epidemiology of porcine epidemic diarrhea（PED） in the Midwest and Southeast regions of the United States［J］. Prev Vet Med，2016，123：155-160.

［18］Duarte M，Laude H. Sequence of the spike protein of the porcine epidemic diarrhoea virus［J］. J Gen Virol，1994，75（Pt 5）：1195-1200.

［19］Hofmann M，Wyler R. Quantitation，biological and physicochemical properties of cell cultureadapted porcine epidemic diarrhea coronavirus（PEDV）［J］. Vet Microbiol，1989，20（2）：131-142.

［20］Jung K，Saif L. Porcine epidemic diarrhea virus infection：Etiology，epidemiology，pathogenesis and immunoprophylaxis. Vet J，2015，204（2）：134-143.

［21］Kadoi K，Sugioka H，Satoh T，et al. The propagation of a porcine epidemic diarrhea virus in swine cell lines［J］. New Microbiol，2002，25（3）：285-290.

［22］Lee D K，Park C K，Kim S H，et al. Heterogeneity in spike protein genes of porcine epidemic diarrhea viruses isolated in Korea［J］. Virus Res，2010，149（2）：175-182.

［23］Park S J，Kim H K，Song D S，et al. Molecular characterization and phylogenetic analysis of porcine epidemic diarrhea virus（PEDV） field isolates in Korea［J］. Arch Virol，2011，156（4）：577-585.

［24］Choudhury B，Dastjerdi A，Doyle N，et al. From the field to the lab - An European view on the global spread of PEDV［J］. Virus Res，2016，226：40–49.

［25］Puranaveja S，Poolperm P，Lertwatcharasarakul P，et al. Chinese-like strain of porcine epidemic diarrhea virus，Thailand［J］. Emerg Infect Dis，2009，15（7）：1112-1115.

［26］孙东波. 猪流行性腹泻病毒S蛋白抗原表位鉴定及受体结合域的初步筛选［D］. 北京：中国农业科学院，2008.

［27］董丽娜，高凤山，许崇波，等. 表达猪流行性腹泻病毒COE片段的重组乳酸菌的构建与鉴定［J］. 畜牧兽医学报，2008（12）：1743-1747.

［28］姜艳平，葛俊伟，汪淼，等. 猪流行性腹泻病毒S基因片段的原核表达及其表达产物的反应原性［J］. 中国兽医科学，2009（7）：602-607.

［29］Jung K，Wang Q，Scheuer KA，et al. Pathology of US porcine epidemic diarrhea virus strain PC21A in gnotobiotic pigs［J］. Emerg Infect Dis ，2014，20（4）：662-665.

［30］Park S J，Kim H K，Song D S，et al. Complete genome sequences of a Korean virulent porcine epidemic diarrhea virus and its attenuated counterpart［J］. J Virol，2012，86（10）：5964.

［31］Chang S H，Bae J L，Kang T J，et al. Identification of the epitope region capable of inducing neutralizing antibodies against the porcine epidemic diarrhea virus［J］. Mol Cells，2002，14（2）：295-299.

［32］Yeo S G，Hernandez M，Krell P J，et al. Cloning and sequence analysis of the spike gene of porcine epidemic diarrhea virus Chinju99［J］. Virus Genes，2003，26（3）：239-246.

（责任编辑 崔建勋）

Molecular epidemiological investigation of PEDV and analysis of genetic variation of S gene in South China during 2011-2015

LI Zhi-li1，HUANG Shu-jian1，MA Jing-yun2，BI Ying-zuo2
（1.School of Life Science and Engineering，Foshan Umiversity，Foshan 528231，China；2.College of Animal Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

The study conducted a large scale molecular epidemiological investigation and five years monitoring of nine swine herds with the outbreak of diarrhea located in geographically separate regions of south China by RT-PCR. Porcine intestinal and fecal samples were collected from 18 swine farms in five provinces （Guangdong province，Guangxi province，Fujian province，Sichuan province，Jiangsu province） in south China with the piglets younger than 7 days old that showed watery diarrhea and dehydration. 35 spike （S） genes were determined to analyze the genetic diversity and epidemiological features during 2011-2015. The results showed that all PEDV strains could be divided into two groups，Group1 and Group 2. Group1 had a close relationship with the United States strains and Taiwan strains，and had four subgroups，G1-1，G1-2，G1-3 and G1-4. Group 2 felled into the same branch with the previous Chinese isolates from 2004 that had two subgroups，G2-1 and G2-2. The subgroup G1-2 and G1-3 comprised most of the strains isolated in south China while the subgroup G2-2 comprised thestrain isolated in 2004 （JS-2004-2） and eight else isolated in south China in our study. It is remarkably that clinical morbidity caused by two types of PEDV strains were quite different，strains in G2-2 caused relatively minor mild clinical manifestations，presenting a smaller mortality and shorter onset period，while strains in G1-2 and G1-3 is caused an outbreak of acute infectious diseases，showing a larger mortality and longer period especially PEDV strains in G1-3.

porcine epidemic diarrhea virus；dynamic investigation；Spike gene；genetic variation

S855.3

A

1004-874X（2016）11-0127-09

2016-07-24

国家自然科学基金（31502071）

李智丽（1983-），女，博士，讲师，E-mail: pinganzhili@163.com

毕英佐（1944-），男，研究员，E-mail: yzbi@scau.edu.cn

李智丽，黄淑坚，马静云，等. 2011—2015年我国南方地区PEDV分子流行病学调查及S基因遗传变异分析［J］.广东农业科学，2016，43（11）：127-135.