不同质量浓度Zn2+对草鱼脑、肝胰脏组织结构及肝胰脏中超氧化物歧化酶活性的影响

任 洪 涛

( 河南科技大学 动物科技学院，河南 洛阳 471003 )

不同质量浓度Zn2+对草鱼脑、肝胰脏组织结构及肝胰脏中超氧化物歧化酶活性的影响

任 洪 涛

( 河南科技大学 动物科技学院，河南 洛阳 471003 )

水温(20±1) ℃，采用静水测试法研究了养殖水体中不同质量浓度Zn2+(0、9.52、13.14、18.30、25.02、34.53 mg/L)对体质量约10 g的草鱼脑和肝胰脏的组织结构及肝胰脏中超氧化物歧化酶活性的影响，探讨重金属的毒性积累和毒性机制。试验结果表明，Zn2+对草鱼的24、48 h和96 h半致死质量浓度分别为23.058、19.317、10.155 mg/L，由公式(48 h LC50×0.3)/(24 h LC50/48 h LC50)2和96 h LC50×0.1计算出安全质量浓度分别为4.068 mg/L和1.0155 mg/L。中毒初期草鱼脑细胞轻微聚集，细胞核微增大；随时间延长脑异常加重，细胞聚集明显，核增大几乎充满整个脑细胞；肝胰脏细胞膨大，离散，核缩小，胞浆轻微溢出，少数肝胰脏细胞胞浆溢出，残留的核物质散乱分布，肝胰脏细胞凝固性坏死。随着Zn2+质量浓度的升高和时间延长，草鱼肝脏中超氧化物歧化酶活性降低。

草鱼；Zn2+；质量浓度；组织器官；超氧化物歧化酶

锌是动物必需的矿物微量元素，具有促进动物生长的作用，大量添加到人工配合饲料中用于集约化养殖生产，常造成锌过剩，通过排泄物释放到土壤和水体中，危害水生动物的健康。Zn2+是锌对水生生物致毒的主要离子形式，多余的Zn2+能够与生物体内的酶和核酸等生物大分子结合，使水生动物中毒。其毒性大小与环境的理化因素、受试生物的种类、规格、生长条件等多种因素有关[1]。草鱼(Ctenopharyngodonidellus)作为我国淡水养殖四大家鱼之一，也是主要的池塘养殖品种，养殖范围与面积非常广，草鱼在全国各地的河流、湖泊、水库中皆有分布。每年的草鱼总产量居于所有水产养殖品种的前列，草鱼肉质细嫩、个体大、肌间刺少；含有丰富的不饱和脂防酸，营养价值非常高；另外草鱼的消化力强，生长快，适应能力强，具有极高的经济和研究价值。目前有关草鱼的研究主要集中在营养价值、转基因抗病、人工繁殖、疾病防治等方面，而对于养殖水环境重金属污染对草鱼毒性效应方面的研究较少。

养殖水环境中的Zn2+的毒性主要取决于Zn2+在生物体内的吸收和积累，所以，研究在一定含量和时间下，Zn2+在草鱼组织中吸收、积累的影响，有利于揭示重金属离子的吸收、积累机制。因此本试验主要研究了养殖水体中不同质量浓度锌对草鱼脑和肝胰脏组织学及肝胰脏中超氧化物歧化酶活性的影响，以期为研究重金属的毒性积累和毒性机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用草鱼购自洛阳市水产市场，暂养3 d后进行试验。暂养期间24 h连续充气，每日投喂市售商品s饲料1～2次，并及时清理残饵及粪便等杂物。正式试验前停食1 d，选取体长8.0～10.0 cm、体质量约10 g、体质健壮、规格整齐的个体进行试验。

试验在6 L水桶中进行。Zn2+由硫酸锌(ZnSO4·7H2O，分析纯，上海化学试剂总厂生产)配制。

1.2 方法

试验用水为曝气24 h的自来水，水温(20±1) ℃，pH 7.0±0.5。试验期间连续充气。每一试验桶中加入1 L的药液， 10尾草鱼，不投喂也不充氧。死亡标准为腹部朝上、失去游动能力、针刺无反应，死亡个体及时捞出。

1.2.1 预试验

配制1000 mg/L的硫酸锌母液，以十倍之差估计系列质量浓度0.5、5、50、500、5000 mg/L，每个质量浓度组放入5尾草鱼，用静态方式进行，试验持续24 h，每日至少2次记录各容器内死鱼数，及时取出死鱼。试验进行2～3次，找出Zn2+的100%致死质量浓度与最小致死质量浓度，记录重金属离子染毒时，草鱼的反应。

1.2.2 正式试验

(1)采用静水生物测试法[2]，试验周期为96 h，根据预试验得出的结果，按等比级数设5个质量浓度组(0、9.52、13.14、18.30、25.02、34.53 mg/L)。每个质量浓度组设3个平行组，每一个系列设一个空白对照，每组用10尾鱼，所有鱼在10 min内转移完毕。连续观察草鱼对Zn2+的行为反应和中毒症状，分别于24、48、96 h记录不同质量浓度下死亡的草鱼尾数，统计各Zn2+质量浓度下不同时间内草鱼的死亡率。

(2)根据各质量浓度状态下不同时间(24、48、96 h)的死亡率，采用直线回归法，求出各种毒物的半致死质量浓度LC50。再根据公式SCⅠ=(48 h LC50×0.3)/(24 h LC50/48 h LC50)和公式SCⅡ=96 h LC50×0.1求出毒物的安全质量浓度[3]。

(3)取出死亡草鱼肝胰脏和脑组织，一部分放入10%甲醛溶液中固定，用来制作组织切片；另一部分装入1.5 mL EP管中，做标记，置于冰箱中-20 ℃保存。采用试剂盒(南京建成生物工程研究所)的方法测定肝胰脏中超氧化物歧化酶的活性。

1.3 数据统计与分析

试验数据采用Excel进行整理；运用SPSS软件中的单因素方差分析检验进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 草鱼Zn2+中毒的行为症状

高质量浓度Zn2+组中的草鱼短时间内就出现明显中毒症状：局促不安、快速游动、乱窜，持续数小时后游泳速度逐渐减缓，反应迟钝，身体失去平衡，与水面成45°角，头露出水面游动，偶尔跃出水面；随后，呼吸困难，失去游泳能力，在水中侧翻、旋转，腹部侧斜并朝向水面，最后侧卧底部不动，仅见鳃盖微动直至死亡。低质量浓度组草鱼中毒症状出现的比高质量浓度组晚，在试验刚开始的数小时内，鱼的行为特征与对照组差异不大，在容器底部缓慢自如地游动，随着染毒时间的延长逐渐失去活力，胸鳍和腹鳍基部充血，对外界刺激反应迟钝。临死前的症状与高质量浓度组相似。

2.2 Zn2+对草鱼的急性毒性

草鱼在不同质量浓度、不同暴露时间的死亡率见表1。

由表1可知，Zn2+质量浓度与草鱼的平均死亡率之间呈现明显的时间效应和剂量效应关系：相同的时间内，草鱼的死亡率随着Zn2+质量浓度升高而增加；相同质量浓度下，草鱼的平均死亡率随着时间的延长而增加。

不同暴露时间下，Zn2+质量浓度与草鱼死亡概率的线性回归方程及相应时间下的半致死质量浓度、安全质量浓度的计算结果见表2。

表1 草鱼在不同质量浓度Zn2+和暴露时间的死亡率

表2 Zn2+对草鱼的急性毒性试验线性回归方程、半致死质量浓度及安全质量浓度

注：y：死亡概率；x：质量浓度对数；n：试验鱼个体数；r：相关系数；LC50：半致死质量浓度；SC：安全质量浓度.

由表2可知，Zn2+对草鱼的24、48、96 h 半致死质量浓度分别为23.058、19.317、10.155 mg/L；由SCⅠ=(48 h LC50×0.3)/(24 h LC50/48 h LC50)2和SCⅡ=96 h LC50×0.1计算出安全质量浓度分别为4.068 mg/L和1.0155 mg/L。随着染毒时间的延长，草鱼对Zn2+的敏感性逐渐增强，半致死质量浓度值越小毒性越强，即24 h半致死质量浓度>48 h半致死质量浓度> 96 h半致死质量浓度。

2.3 Zn2+对草鱼脑和肝胰脏组织结构的影响

组织切片观察发现，Zn2+处理的草鱼脑细胞出现不同程度的异常(图1)。

由图1可见，对照组草鱼脑细胞完整，可以清晰地分辨出细胞轮廓，无异常；Zn2+处理24 h时，脑组织轻微异常，脑细胞轻微聚集，细胞核轻微增大；Zn2+处理96 h时，脑组织异常严重，脑细胞聚集明显，细胞核明显增大，几乎充满整个脑细胞。Zn2+诱导自由基介导过程发生改变，脂质过氧化，生物膜被破坏和细胞功能障碍，以上组织病变程度随处理时间的延长而加深。

Zn2+处理的草鱼肝细胞出现不同程度的异常(图2)。由图2可见，对照组草鱼肝胰脏细胞完整，可以清晰地分辨细胞轮廓，无异常；Zn2+处理24 h时，肝脏细胞结构多不完整，轻微异常，细胞轻微膨大，呈离散状态，细胞核相对缩小，胞浆轻微溢出；Zn2+处理96 h时，肝胰脏细胞明显膨大，无序散程度增大，细胞核明显相对缩小，少数肝细胞胞浆完全溢出，残留的核物质散乱分布，肝细胞出现凝固性坏死，正常壁状结构消失。

图1 Zn2+对草鱼脑组织结构的影响A1：空白对照；A2：Zn2+处理24 h；A3：Zn2+处理96 h，×40.

2.4 Zn2+对草鱼肝胰脏超氧化物歧化酶活性的影响

与对照组相比，24 h时，Zn2+质量浓度13.14 mg/L处理组草鱼肝胰脏超氧化物歧化酶的活性下降不显著(P>0.05)，到96 h时，下降显著(P<0.05)；34.53 mg/L时，24 h和96 h时，草鱼肝脏超氧化物歧化酶活性下降显著(P<0.05)。同一质量浓度下，不同时间相比： 24 h和96 h时13.14 mg/L组草鱼肝胰脏超氧化物歧化酶活性差异显著(P<0.05)； 34.53 mg/L时，24 h和96 h时,草鱼肝脏超氧化物歧化酶活性差异不显著(P>0.05)。同一时间，不同质量浓度条件相比：24 h时，13.14 mg/L和34.53 mg/L组草鱼肝脏超氧化物歧化酶活性差异显著(P<0.05)；96 h，差异不显著(P>0.05)(图3)。

图3 Zn2+作用下草鱼肝胰脏超氧化物歧化酶的活性注：图中标注星号(*)表示相同时间不同质量浓度之间的差异显著(P<0.05).

3 讨 论

3.1 急性毒性试验

本试验中，Zn2+质量浓度与草鱼的平均死亡率之间呈明显的时间效应和剂量效应关系：相同的时间内，草鱼的死亡率随Zn2+质量浓度升高而增加；相同质量浓度下，草鱼的平均死亡率随时间的延长而增加。Zn2+对草鱼的24、48 h和96 h 半致死质量浓度分别为23.058、19.317 mg/L和10.155 mg/L，安全质量浓度分别为4.068 mg/L和1.0155 mg/L。Zn2+对草鱼鱼种的毒性随着染毒时间的延长，草鱼对Zn2+的敏感性逐渐增强，半致死质量浓度值越小毒性越强，即24 h半致死质量浓度>48 h半致死质量浓度>96 h半致死质量浓度。此结果与侯丽萍等[4]的研究结果和张彩明等[5]对日本黄姑鱼(Nibeaalbiflora)和脊尾白虾(Exopalamoncarincauda)的研究的结果一致。但是，本试验得出96 h半致死质量浓度为10.155 mg/L，这与侯丽萍等[4]研究的Zn2+对草鱼96 h半致死质量浓度为5.73 mg/L有差异，且与Zn2+对脊尾白虾[5]96 h半致死质量浓度为0.33 mg/L差异也很大，说明不同物种对Zn2+的耐受能力不同。

3.2 Zn2+对草鱼脑和肝胰脏组织结构的影响

本试验结果表明，随着Zn2+暴露时间的延长，草鱼脑和肝胰脏组织的形态变化和损坏程度加深：脑细胞轻微聚集，细胞核微增大，几乎充满整个脑细胞。肝胰脏细胞结构多不完整，细胞轻微膨大，离散，细胞核相对缩小，胞浆轻微溢出，凝固性坏死。此结果与王少博等[6]对草鱼研究的结果一致。

3.3 Zn2+对超氧化物歧化酶活性的影响

超氧化物歧化酶作为保护酶系统, 能维持体内活性氧产生和清除的动态平衡，防止自由基的毒害。而逆境条件下，细胞中活性氧往往增多或清除能力减弱，在这种情况下，活性氧清除能力的高低也就成为生物抗逆境能力的大小和能否在逆境中生存的关键。本试验结果表明，把草鱼放在含有不同质量浓度Zn2+的养殖水体中后，该平衡被打破，体现于超氧化物歧化酶活性随Zn2+质量浓度的提高而下降。

本试验中，与对照组相比，24 h时，低质量浓度组超氧化物歧化酶活性下降不显著，96 h时，超氧化物歧化酶活性下降显著；高质量浓度组在24 h和96 h时，超氧化物歧化酶活性下降均显著。低质量浓度组在24～96 h之间，超氧化物歧化酶活性下降依然很显著，但高质量浓度组在24～96 h，超氧化物歧化酶活性下降不显著。在急性染毒的24 h和48 h期间，较低质量浓度的镉锌溶液会导致短暂的“毒性兴奋效应”，保护机体免受抗氧化损伤。王重刚等[7-8]研究表明，不利因素对鱼肝脏超氧化物歧化酶诱导作用，本试验结果与上述结论相一致。此结果与张迎梅等[9]对泥鳅的研究结果一致。他们认为，Zn2+能抑制泥鳅的超氧化物歧化酶活性，使超氧化物歧化酶活性降低。由于草鱼肝胰脏组织超氧化物歧化酶活性的降低程度与水体Zn2+污染水平有一定的关系，这一现象可否用Zn2+作为检测水体污染的一种生物学指标，还有待进一步深入研究。

[1] Straus D L. Comparison of the acute toxicity of potassium permanganate to hybrid striped bass in well water and diluted well water [J]. Journal of the World Aquaculture Society, 2004, 35(1):55-60.

[3] 杨先乐, 周剑光, 叶国安, 等. 鱼虫净对白鲢及草鱼夏花的急性毒性研究[J].水产科技情报，1997, 24(1):13-19.

[4] 侯丽萍, 马广智. 镉与锌对草鱼种的急性毒性和联合毒性研究[J]. 淡水渔业, 2002, 32(3):44-46.

[5] 张彩明.几种常见重金属对日本黄姑鱼和脊尾白虾的毒性效应研究[D]. 舟山：浙江海洋学院，2013.

[6] 王少博, 王维民, 郭亚楠, 等. 重金属镉和铬对草鱼苗的急性和慢性毒性效应[J]. 兰州大学学报：自然科学版, 2007, 43(4):60-64.

[7] 王重刚, 郑微云, 余群, 等. 苯并(a)芘和芘的混合物暴露对梭鱼肝脏抗氧化酶活性的影响[J]. 环境科学学报, 2002, 22(4):529-533.

[8] 陈莹, 曹心德, 王晓蓉, 等. 镧及其配合物对鱼体肝脏中酶活性的影响[J]. 环境化学, 2000, 19(1):37-41.

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EffectsofDifferentConcentrationsofZincIononHistologicalStructureofBrainandHepatopancreasandHepatopancreaticSODActivityinGrassCarpCtenopharyngodonidellus

REN Hongtao

( Animal Science and Technology College, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003，China )

The influences of different concentrations of zinc ion (Zn2+) (0, 9.52, 13.14, 18.30, 25.02, and 34.53 mg/L) on histological structure of brain and hepatopancreas and superoxide dismutase(SOD) activity in hepatopancreas were studied in grass carpCtenopharyngodonidelluswith body weight of some 10 g at water temperature of(20±1) ℃ by a hydrostatic test to seek for the accumulation and toxicity mechanism of heavy metals. It was found that the LC50of Zn2+to grass carp was 23.058 mg/L in 24 h, 10.155 mg/L in 48 h, and 19.317 mg/L in 96 h, with safe concentration of 4.068 mg/L calculated by formula(48 h LC50×0.3)/(24 h LC50/48 h LC50)2and 1.0155 mg/L estimated by formula 96 h LC50×0.1. In the early stage of Zn2+poisoning, the grass carp exposed to Zn2+had clustered brain cells with the slightly enlarged nuclei, and as the time elapsed, the brain cells aggregated significantly, and the whole brain cells were almost filled with the nuclei. The hepatopancreas cells were found to be expansion, discrete, nuclear reduction, a slight overflow of the cytoplasm, a small number of liver cell cytoplasm overflow, and residual nuclear material scattered distribution in the grass carp exposed to Zn2+, thus leading to cell necrosis. With the increase in Zn2+concentration and time, the activity of SOD in the hepatopanceas of grass carp was decreased.

Ctenopharyngodonidellus; Zn2+; mass concentration; tissue and organ; SOD

S965.112

A

1003-1111(2016)04-0415-05

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.04.018

2015-09-26；

2015-11-24.

河南科技大学博士科研启动基金资助项目(09001760)；河南科技大学科学研究基金资助项目(2014QN059)；河南科技大学教育教学改革项目(2013Y—003).

任洪涛(1977-)，男，讲师，博士；研究方向:水产动物分子生物学.E-mail:hthn2012@163.com.