Box-Behnken设计-响应面法优化乙醇提取黄芪甲苷工艺研究

王玉，李远辉，王佳，王欢，吴莹，李 希，2

·炮制制剂·

Box-Behnken设计-响应面法优化乙醇提取黄芪甲苷工艺研究

王玉1，李远辉1，王佳1，王欢1，吴莹1，李 希1，2

目的：运用Box-Behnken设计-响应面法优化乙醇提取黄芪甲苷最佳工艺条件。方法：以黄芪甲苷的提取量为考察指标，HPLC-ELSD色谱法为含量测定法，对乙醇浓度、乙醇用量、提取时间、提取次数进行考察，采用Box-Behnken设计-响应面法优化提取工艺。结果：乙醇提取黄芪甲苷最佳工艺条件是乙醇的体积分数为65%，乙醇用量10 倍量，提取时间2 h，提取次数3 次。结论：采用Box-Behnken设计-响应面法优化乙醇提取黄芪甲苷工艺，稳定可行、重现性好。

黄芪甲苷；Box-Behnken响应面法；提取工艺

黄芪(Radix Astragali)为豆科植物蒙古黄芪(Astragalus membranaceus (Fisch.)Beg. Var.mongholicus(Beg.)Hsiao)或膜荚黄芪(A.membranceus(Fish)Beg.)的干燥根。味甘，性微温，具有补气固表、利尿排毒、敛疮生肌、补中益气等功效[1]，是一味常见的扶正中药[2]。据目前研究报道，黄芪主要成分为皂苷、黄酮、多糖等，其中黄芪甲苷是黄芪增强机体免疫功能的主要活性成分之一，也是多种黄芪制剂含量检测指标成分之一[3-6]。

Box-Behnken设计-响应面法是一种优化工艺条件的有效方法，已广泛用于优化中药有效成分提取工艺[7-8]，此方法与正交设计不同，主要通过多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，能够准确表示试验设计与优化结果，准确度高、可预测性强。本实验以黄芪甲苷的提取量为考察指标，HPLC-ELSD为含量测定法，采用Box-Behnken设计-响应面法优化提取工艺，对乙醇浓度、乙醇用量、提取时间、提取次数进行考察，目前没有类似的研究报道。

1 仪器与材料

Agilent1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Alltech2000型蒸发光散射检测器（Agilent公司）；BT125D型分析天平（Sartorius公司）；黄芪甲苷（中国药品生物制品检定所，批号：110781-200613）；黄芪药材（四川禾一天然药业有限公司），按《中国药典》2015年版一部黄芪项下规定检测，均符合要求。甲醇、乙腈为色谱纯，所用水为纯净水，本文中所涉及的其他试剂均为分析纯（成都市科龙化工试剂厂）。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的配制

取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，即得。

2.2 供试品溶液的配制

精密移取提取液适量，水浴挥干，残渣加水10 ml，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40 ml，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40 ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5 ml使溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂柱(内径为1.5 cm，柱高为12 cm)，以水50 ml洗脱，弃去水液，再用体积分数为40%的乙醇30 ml洗脱，弃去洗脱液，继用体积分数为70%的乙醇80 ml洗脱，收集洗脱液，蒸干残渣加甲醇溶解，转移至5 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.3 色谱条件及专属性考察

安捷伦C18色谱柱（4.6×250 mm,5 µm）；流动相为乙腈-水（32∶68，v/v），漂移管温度100 ℃，气体流速为2.6 L．min-1，柱温30 ℃，流速为1 mL．min-1，进样量10 µL，理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000。分别取对照品溶液、空白溶剂、供试品溶液，按上述色谱条件进行试验，HPLC图如下图1。峰型良好，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

图1

2.4 标准曲线制备

分别精密移取不同浓度对照品溶液（0.998,2.001 ,2.999,4.002,4.998,7.005,10.006 mg/mL）各10 µL，以对照品峰面积积分值自然对数为纵坐标，以进样量自然对数为横坐标，进行线性拟合，得回归方程：Y=1.199 0X+6.253 8，(r=0.999 3，n=7)，表明黄芪甲苷浓度在0.998～10.006 mg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验

精密吸取以上对照品溶液，按上述色谱条件重复进样5 次，RSD=1.37%(n=5)，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

精密移取黄芪提取液5 份，每份20 mL，按“供试品溶液的制备”项下操作，并按上述色谱条件测定，RSD=0.91%(n=5)，表明该方法重复性良好。

2.7 加样回收率试验

精密移取上述已知含量的黄芪提取液9 份，每份20 mL，分别按高、中、低浓度精密加入对照品溶液，按“供试品溶液的制备”项下处理，并按上述色谱条件测定，平均回收率=100.1%，RSD=1.21%。表明该方法准确度良好。

2.8 响应面优化实验

2.8.1 响应面实验设计 在查阅文献[9-11]的基础上，以乙醇浓度（X1）、乙醇用量（X2）、提取时间（X3）、提取次数（X4）为考察因素，因素水平表见表1，以黄芪甲苷提取量（Y）为指标，采用Box-Behnken设计方法设计试验，试验设计见表2，使用统计软件Design-Exoert8.0.6，对表2中数据进行多元回归拟合，得到二次多项回归方程模型：Y=11.408-5X1+0.069X2+0.064X3+0.27 X4+0.014X1X2-3X1X3+0.085X1X4+0.024X2X3-0.012X2X4+0.029X3X4-0.19X12+0.02X22-3X32 -0.11X42（r=0.9921，P＜0.01）。统计学分析见表3。

表1 因素与水平

表2 黄芪甲苷提取工艺Box-Behnken试验设计

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表3 回归方程方差分析

由表3可知，F=6.44，此模型P＜0.000 1，表明响应面回归模型具有极显著性；多元相关系数r=0.992 1，表明二次多元方程拟合度良好。可用于优化乙醇提取黄芪甲苷工艺。

2.8.2 响应面分析 应用Design-Expert8.0.6软件绘制乙醇浓度、乙醇用量，提取时间、提取次数的响应面图，如下图2，图3所示。乙醇体积分数为约65%，乙醇用量约为原药材10 倍量时，黄芪甲苷提取量有最大值；提取时间约为2 h，提取次数为3 次时黄芪甲苷提取量有极大值。

图2

图3

2.8.3 工艺优化与验证试验 应用Design-Expert8.0.6软件优化提取工艺，得最佳提取工艺条件为乙醇体积分数65.57%，乙醇用量9.88 倍，提取时间2 h，提取次数3 次，黄芪甲苷提取量可达到1.590 4 mg/g，结合实际生产，优化工艺参数乙醇体积分数65%，乙醇用量10 倍量，提取时间2 h，提取次数3 次。按以上优化结果进行3 次验证试验，结果黄芪甲苷提取量分别为1.580 5，1.590 0，1.588 4 mg/g，平均值为1.586 3 mg/g。与理论预测值相比，其相对误差小于5%，验证值与回归方程预测值吻合较好，说明该模型有良好的预测性。

3 讨论

现代研究表明，黄芪甲苷是黄芪的主要活性成分之一，具有调节机体免疫力，降低血糖、保护组织器官、抗炎抗病毒、抗细胞凋亡等多方面药理作用。目前，工艺优化应用最普遍的是正交设计和均匀设计，但精度不够，建立的数学模型预测性差，因此，本研究采用Box-Behnken设计-响应面法，在因素与响应值之间建立非线性模型，从众多影响因素中筛选出显著影响因素，通过对试验结果的统计分析比较，优化得到最佳工艺条件为：乙醇体积分数65%，乙醇用量10 倍量，提取时间2 h，提取次数3 次，在此条件下黄芪甲苷的提取量为1.590 4 mg/ g，精确度高，可预测性强，重现性好。本研究采用Box-Behnken设计-响应面法优化提取工艺，为工业化大生产提供了科学依据。

[1]中国药典.一部[S].2015:283.

[2] 沈小钟,杨 帆,于荣敏.黄芪甲苷的研究进展[J].沈阳药科大学学报.2011.28(5):410-414.

[3] 昝丽霞.黄芪的乙醇提取工艺优化研究[J].安徽农业科学,2009,37(9);41101.

[4] 王鑫,张振秋,吕佳,等.黄芪提取工艺研究[J].中国实验方剂学杂志,2010,16(9):17.

[5] 陈涛,李进,褚治德,等.黄芪药材的微波提取工艺研究[J].时珍国医国药,2009,20(2):349.

[6] 昝日增,胡万杨,余跃,等.黄芪中主要活性成分提取工艺的研究[J].中华中医药学刊,2010,28,(12):2570.

[7] 叶良红,朱红云,李芸霞.响应面法优化大黄附子药对中蒽醌类成分的提取工艺[J].中药与临床,2011,2(4):16.

[8] 董自亮,徐瑞超.基于Box-Behnken设计响应面法优化白芷香豆素闪式提取工艺[J].中药与临床,2013,4(1):13.

[9] 杨晓雷,曹云.从黄芪生药中提取黄芪甲苷的工艺研究[J].现代化工,2008,28增刊(2):373.

[10] 郑晓峰.正交试验优选黄芪甲苷的分离纯化工艺[J].中国药房,2008,19(21):1630.

[11] 赵强强,韩丽,谢兴亮,等.田口试验设计法优选黄芪皂苷的提取工艺[J].中成药,2010,32(11):1988.

（责任编辑：傅舒）

Study on extraction technology of Astragaloside A with ethanol using Box-Behnken design-response surface methodology

WANG Yu1, LI Yuan-hui1, WANG Jia1, WANG Huan1, WU Ying1, LI Xi1,2//(1.School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610075, Sichuan; 2.Institute of TCM, Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine sciences, Chengdu 611137 Sichuan )

Objective: To optimize the extraction conditions of Astragaloside A with ethanol using Box-Behnken designresponse surface methodology. Method: Astragaloside A content was detected by HPLC-ELSD method. With Astragaloside A extraction amount as index, ethanol concentration, ethanol volume, extraction time, and extraction times were investigated using Box-Behnken design-response surface method to optimize the extraction process. Result: The optimum conditions for ethanol extract of Astragaloside A was 65% ethanol, 10 volume ethanol, extraction time 2h, extracted 3 times. Conclusion: The extraction technology of Astragaloside A with ethanol optimized using Box-Behnken design-response surface methodology is stable, feasible and reproducible.

Astragaloside A; Box-Behnken response surface methodology; extraction technology

R283.3

A

1674-926X(2016)04-003-03

1. 成都中医药大学，四川 成都 611137

2. 四川省中医药科学院中医研究所，四川 成都 610031

王玉，在读研究生，从事中药新药、新技术、新工艺、新剂型的研究工作

Tel:18382284431 Email:272429134@qq.com

李希，硕士，教授，从事中药新药、新技术、新工艺、新剂型的研究工作

Tel:18030897734 Email:1836820767@qq.com.

2015-09-18