黄柏中多种生物碱测定的NIR模型的建立

吴珊珊，胡麟，龚晓猛，李梦琪，吴文辉，李文兵，胡昌江

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黄柏中多种生物碱测定的NIR模型的建立

吴珊珊1，胡麟1，龚晓猛1，李梦琪1，吴文辉1，李文兵2，胡昌江1

目的：建立黄柏中3个成分（木兰花碱、黄柏碱、小檗碱）测定的NIR模型。方法：以高效液相测定的黄柏生物碱含量值作为参照，运用近红外漫反射光谱采集49批不同产地样品的近红外漫反射光谱，采用偏最小二乘算法( PLS) 建立校正模型，比较不同的预处理方法及不同的波段对建模的影响。结果：以MSC+2D2为预处理方法，建立的小檗碱、黄柏碱、木兰花碱模型交互验证均方根误差（RMSEC）分别为0.0453、0.0335 、0.0396，相关系数（R2）分别为0.9995、0.9760、0.9306。结论：建立的NIR模型稳定准确可靠，适用于生产中快速在线检测。

近红外光谱；黄柏；PLS；生物碱

黄柏是“三木药材”之一，始载于《神农本草经》，列为上品。具有两千多年的药用历史。性味苦、寒，具有清热燥湿、泻火解毒之功效[1]。盐炙可引药入肾，缓和苦燥之性，增强滋肾阴、泻相火、退虚热的作用；酒炙后可降低苦寒之性，免伤脾阳，并借酒升腾之力，引药上行，清血分湿热。[2]黄柏中主要成分有小檗碱、黄柏碱、木兰花碱、巴马汀、药根碱等生物碱类，其中含量最高的为小檗碱[3,4]。目前，黄柏质量控制的方法主要是通过运用相应的对照品进行黄柏药材中不同成分的含量测定以及运用指纹图谱方法控制黄柏的整体质量。需要经过复杂的样品制备和预处理，分析时间长。近红外(near infrared, NIR) 光谱分析是近年来快速发展的一种分析技术，适合于复杂天然产物的定性和定量分析。与传统分析技术相比，近红外光谱分析技术被测样品用量小、无破坏、无污染，具有高效、快速、成本低和绿色的特点。[5～8]因此，近红外光谱在中草药及其产品的定量定性两方面都得到应用。因其快速简便，在药厂中也广泛应用于药材中间产物和成品的质量控制。在定性分析中，常用于中药材真伪、产地的鉴别及相似、相近药材的区分和鉴定。定量分析中主要用于有效成分含量的测定。[9～11]本实验以黄柏为研究对象，以高效液相作为参比方法，采集黄柏粉末近红外光谱图，采用偏最小二乘法建立定量校正模型，实现对黄柏中几种生物碱含量的快速、简便、准确测定。

1 仪器与材料

Antaris Ⅱ傅里叶变换近红外光谱仪（配有Thermo Result信号采集软件，TQ Analyst数据处理软件，积分球漫反射采样系统），Agilent 1200 高效液相系统，FE20梅特勒-托利多pH 计，Sartorius BP211D 电子分析天平，KQ-300E 超声仪（40 kW），乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。木兰花碱（Must-12022901）、盐酸黄柏碱（Must-12021407）、和盐酸小檗碱（Must-111212110）均购自成都曼思特生物制品检定所，HPLC（峰面积归一化法）纯度为98%。

49批黄柏购自四川、贵州、湖南、湖北等地药材市场和饮片公司，经本校生药室教研室卢先明老师鉴定为黄皮树Phellodendron chinense Schneid.的干燥树皮。

2 实验方法

2.1 近红外光谱的采集

样品过4号筛，装入样品杯中，采集方式为积分球（旋转样品），扫描范围10 000～4 000 cm-1，扫描64 次，增益2X，分辨率8 cm-1，empty 门衰减。每份样品重复扫描3 次， 计算平均光谱， 每次扫描前都要对样品进行混匀。图1为49批黄柏样品的近红外光谱叠加图。

图1 不同产地黄柏近红外原始光谱图

2.2 HPLC含量测定[12]

2.2.1 HPLC测定生物碱含量条件 同时利用高效液相色谱法测定各批次黄柏粉末中木兰花碱、黄柏碱和小檗碱的含量。其测定条件为流动相A：乙腈-0.05 mol．L-1磷酸二氢钾（KH2PΟ4）（45∶55）（每100 mL 中加入0.4 g十二烷基硫酸钠，调节pH值至4.8），流动相B：乙腈-0.05 mol．L-1KH2PΟ4（55∶45）（每100 mL 中加入0.4 g 十二烷基硫酸钠，调节pH值至4.5），梯度洗脱程序0～12 min，0 B， 12～18 min， 0～100% B ， 18～40 min，100 %B， 40～42 min，100～0% B，42～48 min 0% B。流速 1 mL．min-1，检测波长280 nm。

2.2.2 样品含量测定 对49份样品进行HPLC含量测定，每份样品平行测量2次，计算平均值。样品中木兰花碱、小檗碱、黄柏碱的含量范围分别为0.10～1.01%、1.22～9.53%、0.19～0.90%。

2.3 模型的建立的方法

将49 份样品的近红外光谱与HPLC 值相关联，输入到TQ 8.0定量分析软件中，随机分为校正集和验证集，要保证验证集的含量范围在校正集的含量范围之内。采用偏最小二乘法(PLS) 建立定量分析模型，用验证集验证该模型，并以校正集决定系数(R2)、校正集均方差(RMSECV) 、预测均方差(RMSEP) 作为评价指标来优化模型性能。R2越大、RMSECV 越小， 表明模型结构越合理，RMSEP 越小，表明模型的预测性能和推广能力越强。

2.4 光谱预处理方法的选择

运用光谱分析软件进行数据处理，比较主成分回归法(PCR)和偏最小二乘法(PLS)的建模结果。结果表明PLS所建立的模型R2较大而RMSEC，表明所建模型适用性强、预测效果好，优于PCR法，故选定采用PLS法建立定量校正模型。

本实验首先结合多元散射校正(MSC)以及标准正态变量转换(SNV)两种方法进行光谱预处理，同时进行数学处理，主要用导数和Norris平滑对NIR光谱进行预处理，用以消除光谱散射和基线飘移，导数光谱分别采取一阶导数和二阶导数处理。结果见表1。

表1 不同预处理方法对校正模型影响

2.5 波段的选择

PLS全谱建模需要大量计算，同时易引入过多冗余信息，因此需对建模波段进行选择，提高模型的准确性。本实验以MSC+2D2为预处理方法，根据R2、RMSEC值作为指标选择较优的波段。最终确定4342.91-5006.3,5804.68-7500,8000-10000为建模波段。考察结果见表2。

表2 光谱波段选取对PLS 模型影响

2.6 校正模型的建立及验证

根据不同产地黄柏和黄柏样品中的生物碱分布情况，从49份样品中选择34个样品作为校正集，15个样品作为验证集。为使校正集样品更具代表性，验证集样品的生物碱含量范围应在校正集含量之内，结果见图2。用样品的校正集建立校正模型，再做交叉检验。最后用验证集样品对模型进行外部验证。

图2 小檗碱 (A)、黄柏碱 (B)、木兰花碱 (C) 的校正集样品预测值与测量值之间的相关图

3 讨论

本研究通过NIR 光谱法对黄柏主要生物碱进行含量测定，实验考察PLS法和PCR法，结合多元散射校正(MSC) 以及标准正态变量转换(SNV) 两种方法进行光谱预处理，最终选择用PLS法，MSC+2D2为预处理方法。该方法高效，快速，一个样品只需1～2 min便可得出结果。同时，样品预处理方法简单，测定过程中对样品无污染，为黄柏的快速评价和在线检测提供了参考和依据。但本试验样品批次较少且不包括炮制品和和配方颗粒等饮片形式的样品，因此要建立完全适合生产科研精度需要的相关分析模型，有待于进一步的研究分析。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部[S].北京:中国医药科技出版社,2010: 286.

[2] 龚千锋.中药炮制学[M].北京: 中国中医药出版社,2003: 220.

[3] 李行诺,翟文丰,周孟宇,等.黄柏化学成分研究[J].浙江工业大学学报,2012,40(3):244.

[4] 刘仁俊.黄柏化学成分及药理作用浅谈[J].中国中医药现代远程教育,2011,9 (13) :83.

[5] 阮治纲,李彬.近红外光谱分析技术的原理及在中药材中的应用[J].药物分析杂志,2011, 31(2):408.

[6] 周云,臧恒昌.近红外分析技术在中药鉴定及含量测定方面的研究进展[J].食品与药品,2009, 11(1):72.

[7] 王亚敏,张卓勇,汤彦丰,等.近红外光谱技术在中药鉴别及分析中的应用[J]. 首都师范大学学报(自然科学版), 2004,

25(3):41.

[8] 褚小立,袁洪福,陆婉珍. 近年来我国近红外光谱分析技术的研究与应用进展[J]. 分析仪器, 2006,(2):1.

[9] 杜伟锋,王胜波,葛卫红.近红外光谱法测定白芍中芍药苷含量[J].中华中医药学刊,2013,31(3):483.

[10] 白雁,刘建营,雷敬卫等.近红外光谱技术快速测定杞菊地黄丸的水分含量[J].中国现代应用药学,2013, 30 (1):52.

[11] 刘国林,蔡金娜,李伟等.近红外光谱技术在中药蛇床子分类中的应用[J].计算机与应用化学2000,17(1):109.

[12] 吴珊珊,胡昌江,吕非非.一测多评法测定黄柏中5种生物碱[J].中成药2014,36(1):130.

（责任编辑：胡慧玲）

Determination of alkaloid in Huangbo by near infrared diffuse reflectance spectroscopy

WU Shan-shan1, HU Lin1, GONG Xiao-meng1, LI Meng-qi1, WU Wen-hui1,LI Wen-bing2, HU Chang-jiang1//(1. School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan; 2. Neo-green Pharmaceutical Co.LTD, Chengdu 611930, Sichuan)

Objective: A near-infrared (NIR) quantitative method was developed for rapid determination of three components (magnoflorine, phellodendrine, and berberine) in Huangbo. Method: Using alkaloid contents measured by HPLC as reference, near infrared diffuse reflectance spectroscopy of 49 samples were collected. Then partial least square algorithm (PLS) was applied to establish a calibration model, and compare the influence of different pretreatment method and different wave on modeling. Result: Taking MSC +2 D2as pretreatment method, model correlation coefficient (R) for berberine, phellodendrine, magnoflorine were 0.9995, 0.9760 and 0.9306 with RMSEC of 0.0453, 0.0335 and 0.0396, respectively. Conclusion: The method is accurate and reliable, and can be applied for the rapid online detection.

Near infrared spectrum; Huangbo; partial least square algorithm; alkaloid

R282.6

A

1674-926X(2016)04-002-03

中医药行业科研专项（201007012-3-2）

成都中医药大学药学院 成都 611137; 2.四川新绿色科技发展股份有限公司 成都 611930

吴珊珊（1989-），女，在读博士研究生，主要从事中药炮制机理研究

Tel:15802825791 Email:569222020@qq.com

胡昌江（1952-），男，教授，博士研究生导师，主要从事中药炮制机理研究

Email:hhccjj@hotmail.com

2015-09-10