半乳糖凝集素1表达下调对食管鳞癌细胞周期及迁移能力的影响及机制

张 卉 赵江海 索智敏

(河南大学淮河医院消化内科，河南 开封 475000)



半乳糖凝集素1表达下调对食管鳞癌细胞周期及迁移能力的影响及机制

张 卉 赵江海 索智敏

(河南大学淮河医院消化内科，河南 开封 475000)

目的 观察半乳糖凝集素1(Galectin-1)表达下调对食管鳞癌细胞周期及迁移能力的影响及机制。方法 利用脂质体2000转染食管鳞癌EC9706细胞。细胞分为3组，即未处理组、对照siRNA组和Galectin-1 siRNA组。采用半定量RT-PCR、免疫细胞化学检测各组食管鳞癌EC9706细胞中Galectin-1 mRNA和蛋白的表达；运用流式细胞术分析Galectin-1表达下调对食管鳞癌细胞周期的影响，采用Boyden小室分析Galectin-1表达下调对食管鳞癌细胞迁移能力的影响。采用半定量RT-PCR和Western 印迹方法检测Galectin-1表达下调对细胞周期相关因子(cdk2、p27和p21)以及细胞迁移相关因子基质金属蛋白酶(MMP)-14 mRNA和蛋白的表达水平的变化。结果 Galectin-1 siRNA组与未处理组和对照siRNA组相比，Galectin-1 siRNA组中Galectin-1 mRNA和蛋白的表达均显著下调(P<0.05)；细胞周期在G0/G1期的细胞数呈显著升高(P<0.05)；细胞的穿膜数明显下降。Galectin-1 siRNA组中p27和p21 mRNA和蛋白的表达均显著高于未处理组和对照siRNA组(均P<0.05)，而cdk2和MMP-14 mRNA和蛋白的表达均显著低于未处理组和对照siRNA组(均P<0.05)。结论 Galectin-1 siRNA能有效下调食管鳞癌EC9706细胞中Galectin-1 mRNA和蛋白的表达；Galectin-1表达下调能明显抑制食管癌EC9706细胞周期静止在G0/G1期，这可能与p21和p27表达的升高及cdk2表达的下调密切相关；并能降低食管鳞癌EC9706细胞的迁移，这可能与MMP-14表达的下调有关。

食管鳞癌；Galectin-1；细胞周期；细胞迁移

食管鳞癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，治疗主要采用外科手术联合放、化疗等辅助治疗手段，但患者预后仍不乐观。半乳糖凝集素(Galectins)是能与β-半乳糖苷结合的高度保守的一类蛋白家族。研究表明其参与多种细胞生物学过程，包括炎症反应、细胞通讯、细胞存活、细胞生长以及趋化性〔1〕。本研究观察Galectin-1表达下调对食管鳞癌细胞周期及迁移能力的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂与细胞株 Galectin-1、β-actin兔抗人多克隆抗体、Galectin-1 siRNA、阴性对照siRNA购自Santa Cruz公司。脂质体购自Invitrogen公司。食管鳞癌EC9706细胞购自中国科学院上海细胞研究所细胞库。其他常用剂由河南大学病理学实验室提供。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞分组 未处理组：未转染的EC9706细胞；对照siRNA组：用阴性对照siRNA转染的EC9706细胞；Galectin-1 siRNA组：利用Galectin-1 siRNA转染的EC9706细胞。

1.2.2 细胞培养与基因转染 将EC9706细胞加入RPMI-1640培养基，置于37℃，CO2培养箱中培养。按试剂盒说明制备siRNA和脂质体的混合物，并加入培养板中，在培养箱中孵育4～6 h后更换培养基，转染后48 h进行后续实验。

1.2.3 半定量RT-PCR 用Trizol试剂进行消化、裂解EC9706细胞。接着测光密度(OD)值定量RNA浓度，完成cDNA第一链的合成、目的基因的扩增后利用Gene Tools软件进行灰度值分析。每个基因 mRNA的相对表达量=目的基因/内参β-actin。

1.2.4 免疫细胞化学 将已消毒的20 mm盖玻片置于3组不同细胞的90 mm培养皿中，按2×104ml的细胞密度将细胞接种于培养皿中进行细胞爬片的制备，5 d后进行免疫细胞组织化学染色鉴定。Galectin-1一抗滴度1∶200。最后树胶封片，利用显微镜进行观察。

1.2.5 细胞周期分析 取转染后48 h的3组细胞，用0.2 %胰蛋白酶消化，1 000 r/min离心5 min，弃去上清；用PBS洗两遍，离心后弃去，加入70 %冰乙醇固定30 min，4℃过夜；上机前，1 000 r/min离心5 min，弃去乙醇，PBS漂洗3遍；加入1 ml PBS制成细胞悬液，加Rnase A(终浓度50 μg/ml)，室温放置1 h；调整细胞浓度为1×106，加1 ml碘化吡啶(100 μg/ml)，避光30 min，最后通过流式细胞仪检测细胞周期。

1.2.6 细胞迁移分析 利用Boyden小室分析3组细胞的迁移能力的变化。上下室之间用聚碳酸酯膜分开，膜上铺人工基底膜Matrigel 120 μg/cm2，下室的微孔中加入已培养过的细胞的上清作为诱引剂，在上室的微孔中各加入细胞悬液25 μl (浓度为5×105个/ml)，37℃，5% CO2培养箱培养6 h；取出膜，轻轻擦去Matrigel matrix、尚未转移至膜上的细胞，将膜用70%甲醇固定45 min，未结合型苏木素染色5 min，流水冲洗终止；观察迁移至膜上的细胞，每孔计数5个高倍镜视野中的细胞数总和，求其平均值。穿膜细胞数目多少作为评价肿瘤细胞浸润能力强弱的指标。

1.2.7 Western印迹 按照全蛋白提取试剂盒说明书提取细胞质、细胞核蛋白，蛋白上清经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(4%浓缩胶，15%分离胶)后转移至硝酸纤维素膜，用含5%脱脂奶粉的封闭液中封闭60 min。一抗(cdk2、p27、p21、 MMP-14)于4℃孵育过夜，TBST洗涤3次×10 min；辣根过氧化物酶标记的二抗于室温孵育1 h，TBST洗涤3次×10 min，膜与化学发光底物孵育5 min，经X线片曝光、显影、定影。显色结果用Gene Tools软件进行灰度分析，蛋白相对表达量=目的基因的表达量/内参基因的表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行t检验。

2 结 果

2.1 Galectin-1 siRNA对EC9706细胞中Galectin-1 mRNA表达的影响 Galectin-1 siRNA组中Galectin-1 mRNA的表达显著下调(P<0.05)，而未处理组和对照siRNA组中Galectin-1 mRNA的表达无显著性差异(P>0.05)。见图1。

2.2 免疫细胞检测干扰前后Galectin-1蛋白表达的变化 利用免疫细胞化学方法检测干扰前后3组细胞Galectin-1蛋白的表达。结果显示，Galectin-1蛋白主要定位在胞质中。在未处理组和对照siRNA组中，Galectin-1蛋白呈现强表达，而在Galectin-1 siRNA组中Galectin-1的表达水平极低。见图2。

M：GeneRulerTM DNA Ladder Mix；1：未处理组；2：对照siRNA组；3：Galectin-1 siRNA组，下图同图1 Galectin-1 siRNA下调食管鳞癌EC9706细胞中Galectin-1 mRNA表达

图2 免疫细胞化学检测各组细胞中Galectin-1蛋白的表达(DAB，×200)

2.3 采用流式细胞仪进行分析Galectin-1表达下调对细胞周期的调控 结果显示，Galectin-1 siRNA组在G0/G1期的细胞数比率(67.30±0.77)%明显高于未处理组(55.31±1.01)%和对照siRNA组(55.03±1.62)%(F=104.195，P=0.000)。此外，Galectin-1 siRNA组在S期的细胞数比率(24.53±1.19)%显著低于未处理组(31.35±1.17)%和对照siRNA组(31.85±0.84)%(F=43.186，P=0.000)，进一步分析表明，Galectin-1 siRNA组在G2/M期的细胞数比率(8.18±0.57)%显著低于未处理组(13.33±0.75)%和对照siRNA组(13.12±0.93)%(F=44.047，P=0.000)。而未处理和对照siRNA组在细胞周期的各个时相无差异(P>0.05)。

2.4 Boyden小室进行检测 Galectin-1表达下调对细胞迁移能力的影响 Boyden小室结果显示，未处理组和对照siRNA组细胞穿膜数分别为(156.71±5.59)及(149.35±6.10)，二者相比无统计学差异(P>0.05)，然而与未处理组和对照siRNA组相比，Galectin-1 siRNA组中EC9706细胞的穿膜数(61.33±3.28)明显下降(F=319.991，P=0.000)。见图3。

2.5 Galectin-1表达下调对相关基因mRNA表达的影响 图4表明，Galectin-1 siRNA组中p27和p21 mRNA的表达显著高于未处理组和对照siRNA组(均P<0.05)，而cdk2和MMP-14 mRNA的表达显著低于未处理组和对照siRNA组(均P<0.05)。此外，未处理组和对照siRNA组之间上述各基因的表达无差异(P>0.05)。这些研究提示，Galectin-1表达下调所介导的细胞周期静止和细胞迁移能力的降低与上述各基因mRNA表达的变化密切相关。

图3 Galectin-1表达下调对食管鳞癌EC9706细胞迁移的影响(×200)

图4 Galectin-1表达下调相关基因mRNA表达

2.6 Galectin-1表达下调对相关蛋白表达的影响 Galectin-1 siRNA组中p27和p21蛋白的表达显著高于未处理组和对照siRNA组(均P<0.05)，而cdk2和MMP-14蛋白的表达显著低于未处理组和对照siRNA组(均P<0.05)，见图5。此外，未处理组和对照siRNA组之间上述各蛋白的表达无统计学差异(P>0.05)，提示Galectin-1表达下调所介导的细胞周期静止和细胞迁移能力的降低与上述各蛋白表达的变化密切相关。

图5 Galectin-1表达下调对细胞周期相关蛋白和浸润转移相关蛋白表达的影响

3 讨 论

Galectins是能与β-半乳糖苷结合的高度保守的一类蛋白家族。这类蛋白家族分布广，进化上十分保守。当前大多数研究认为Galectins在细胞凋亡中的免疫调节和免疫应答以及在肿瘤的发生发展中发挥重要作用〔2〕。已有研究发现在多种肿瘤细胞与组织中Galectin-1呈现高表达〔3〕，然而Galectin-1在食管鳞状细胞癌中表达情况的国内外研究报道较少。已有研究证实RNA干扰技术可以抑制肿瘤细胞中癌基因的过度表达，该技术将成为治疗肿瘤的一种新的措施〔4～6〕。本研究结果显示，Galectin-1 siRNA转染后的食管鳞癌EC9706细胞中Galectin-1 mRNA和蛋白的表达明显下调，同时也说明食管鳞状细胞癌细胞中存在Galectin-1 基因及蛋白的表达，进一步为后续研究Galectin-1在食管鳞状细胞癌中的作用提供理论依据。

Galectin-1在调控细胞的细胞周期的进程中发挥极其重要的作用。Galectin1能抑制多种肿瘤细胞的生长，如神经母细胞瘤和基质骨髓细胞〔7〕。本研究表明Galectin-1 siRNA能明显诱导细胞周期静止在G0/G1期，并阻碍DNA的合成的正常进行。但是其相关的分子机制尚不清楚。有研究表明，Galectin1能诱导p21的转录和选择性增加p27蛋白的稳定性，而Galectin1介导的p27和p21的积累抑制细胞周期依赖性激酶2的活性，这将最终导致细胞周期静止在G1期和生长的抑制〔8〕。为了探讨Galectin-1表达下调介导的细胞周期静止与cdk2、p27和p21的表达是否有关，本文结果提示Galectin-1表达的下调介导的细胞周期静止与p27和p21蛋白的表达的升高和cdk2蛋白表达的降低密切相关。为了证实Galectin-1表达下调对食管鳞癌EC9706细胞迁移的影响，本文结果表明Galectin-1表达的下调能明显抑制食管鳞癌EC9706细胞的迁移。MMP-14作为一种蛋白水解酶，可降解基底膜和细胞外基质成分，促使肿瘤细胞迁移。由于Galectin-1是乳腺癌中MMP-14的底物〔9，10〕，本文结果显示下调Galectin-1表达所介导的EC9706细胞迁移能力降低可能与MMP-14表达的下调密切相关。

1 He J,Baum LG.Galectin interactions with extracellular matrix and effects on cellular function〔J〕.Methods Enzymol,2006；417(2):247-56.

2 初钊辉，梁晓华.半乳糖凝集素在肿瘤微环境中的免疫调节作用〔J〕.国际肿瘤学杂志,2011；38(11):826-9.

3 Chung JC,Oh MJ,Choi SH,etal.Proteomic analysis to identify biomarker proteins in pancreatic ductal adenocarcinoma 〔J〕.ANZ J Surg,2008；78 (4):245-51.

4 Li S,Xi Y,Zhang H,etal.A pivotal role for Pim-1 kinase in esophageal squamous cell carcinoma involving cell apoptosis induced by reducing Akt phosphorylation 〔J〕.Oncol Rep,2010；24 (4):997-1004.

5 Xu C,Lee SA,Chen X.RNA interference as therapeutics for hepatocellular carcinoma 〔J〕.Recent Pat Anticancer Drug Discov,2011；6(1):105-15.

6 Zhou L,Picard D,Ra YS,etal.Silencing of thrombospondin-1 is critical for myc-induced metastatic phenotypes in medulloblastoma 〔J〕.Cancer Res,2010;70 (20):8199-210.

7 孙海波，李 静，安鼎伟，等.RNA 干扰沉默STAT3 基因表达对人大肠癌细胞生物学行为的影响〔J〕.中国老年学杂志，2010;30(17):2446-8.

8 Andersen H,Jensen ON,Moiseeva EP,etal.A proteome study of secreted prostatic factors affecting osteoblastic activity:galectin-1 is involved in differentiation of human bone marrow stromal cells 〔J〕.J Bone Miner Res,2003；18 (2):195-203.

9 Fischer C,Sanchez-Ruderisch H,Welzel M,etal.Galectin-1 interacts with the {alpha}5{beta}1 fibronectin receptor to restrict carcinoma cell growth via induction of p21 and p27 〔J〕.J Biol Chem,2005；280 (44):37266-77.

10 Butler GS,Dean RA,Tam EM,etal.Pharmacoproteomics of a metalloproteinase hydroxamate inhibitor in breast cancer cells:dynamics of membrane type 1 matrix metalloproteinase-mediated membrane protein shedding 〔J〕.Mol Cell Biol,2008；28(15):4896-914.

〔2015-05-11修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

索智敏(1969-)，女，教授，硕士生导师，主要从事消化道肿瘤研究。

张 卉(1980-)，女，硕士，主治医师，主要从事消化道肿瘤研究。

R735.1

A

1005-9202(2016)22-5534-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.018