S100B蛋白和胶质纤维酸性蛋白在原发性脑干损伤后的表达

张丽勇 曹红十

(白城医学高等专科学校生理教研室，吉林 白城 137000)



S100B蛋白和胶质纤维酸性蛋白在原发性脑干损伤后的表达

张丽勇 曹红十1

(白城医学高等专科学校生理教研室，吉林 白城 137000)

目的 探讨原发性脑干损伤后脑干组织中S100B蛋白和胶质纤维酸性蛋白的表达规律。方法 56只SD大鼠中随机取7只作对照组，其余49只采用机械撞击法建立大鼠原发性脑干损伤模型，7只大鼠击打30 min内死亡，记为击打后30 min组；存活的42只大鼠随机分为6组，每组7只，分别于击打后2、6、12、24、48、72 h断髓处死。采用Gless嗜银染色，SP免疫组化法观察并测定不同损伤时间大鼠脑干组织中S100B蛋白和胶质纤维酸性蛋白表达情况。结果 S100B蛋白表达量从脑干损伤后30 min开始增加，随时间延伸逐渐升高，损伤后24 h达到峰值并开始下降，损伤后72 h基本恢复至正常水平并与对照组比较无统计学差异(P>0.05)。胶质纤维酸性蛋白量从脑干损伤后30 min开始增加，损伤后48 h达到峰值并开始下降，但损伤后72 h仍高于对照组(P<0.05)。结论 原发性脑干损伤后S100B蛋白和胶质纤维酸性蛋白表达具有明显规律性，在起病时间的推断和神经修复过程中具有重要意义。

脑干损伤；S100B蛋白；胶质纤维酸性蛋白

脑损伤后中枢神经系统中星形胶质细胞常出现增生，这是退行性病变及中枢神经损伤引发神经组织变化的主要表现。S100B蛋白和胶质纤维酸性蛋白是两种主要的神经胶质细胞标记蛋白〔1〕，研究其在脑干损伤后不同时间的变化规律有助于较精准地推断原发性脑干损伤患者的发病时间，采取有针对性的治疗方案从而改善预后。本次研究通过检测损伤后不同时间段大鼠脑干组织中S100B蛋白和胶质纤维酸性蛋白的表达情况，分析其在原发性脑干损伤中的作用机制及变化规律。

1 材料与方法

1.1 动物及主要试剂 SPF级SD大鼠56只，体质量(200±20)g，购于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。SP免疫组化检测试剂盒、兔抗大鼠胶质纤维酸性蛋白多克隆抗体、DAB显色试剂盒均购于上海研卉生物科技有限公司；大鼠抗S100B蛋白多克隆抗体购于上海瑞齐生物科技有限公司。

1.2 模型建立及分组 随机取7只大鼠作对照组，其余49只大鼠建立原发性脑干损伤模型。撞击装置为自行设计，在铁支架上固定一根内径为1.5 cm的光滑导管，支架底座固定一木板，前端垂直放置一个小挡板，调整导管角度使其与底座之间呈45°夹角。大鼠按300 mg/kg腹腔注射100 g/L的水合氯醛麻醉，清除头颅表面皮毛后暴露颅骨，大鼠在底座上取俯卧位，将导管对准枕骨粗隆段，击打装置从导管远端自由下滑对枕部进行打击，每只大鼠击打1次，造成原发性脑干损伤。7只大鼠击打30 min内死亡，记为击打后30 min组；存活的42只大鼠采用随机数字法分为6组，每组7只，分别于击打后2、6、12、24、48、72 h断髓处死；对照组大鼠直接断髓处死。

1.3 标本采集和检测 大鼠处死后立即开颅取脑干组织，在4%多聚甲醛溶液中固定1 d。沿正中线将脑干组织切开，将横切面作为包埋面常规组织脱水，石蜡包埋后3 μm连续切片，分别行Gless嗜银染色和免疫组化染色。使用Motic数字切片扫描与应用系统，显微镜放大400倍，随机取7个视野，对免疫组化阳性细胞进一步测定S100B蛋白、胶质纤维酸性蛋白表达的灰度值。

1.4 统计学分析 采用SPSS21.0软件行方差分析和t检验。

2 结 果

2.1 大鼠临床症状观察 实验组大鼠受打击后即刻出现昏迷、呼吸急促、角膜反射消失等体征。击打后30 min组大鼠在受打击后出现心律不齐、呼吸不规律，20～30 min心脏搏动停止。伤后存活大鼠在受打击后15～20 min呼吸和心脏搏动基本恢复到正常水平，约60 min后苏醒，生命体征平稳。脑干损伤大鼠均可见脑干水肿，明显的蛛网膜下腔出血，后30 min组出血部位较多。

2.2 Gless嗜银染色 对照组大鼠脑干组织轴索走行、排列规律，间隙均匀分布。击打后30 min组大鼠呈弥散性分布的轴索扭曲、肿胀，间隙宽度明显增加、末端肿大。击打后2、6 h组大鼠脑干中以轴索扭曲、肿胀为主要特征的变化更明显；击打后12 h组大鼠可见轴浆从轴索中流出，进入脑干组织局部产生的轴索收索球，见图1；击打后24 h大鼠脑干组织中可见轴索收索球体积和数量增加；击打后48、72 h组大鼠脑干组织中轴索肿胀程度明显减轻。

图1 大鼠脑干损伤12 h后形成的轴索收索球(Gless嗜银染色，×400)

2.3 各组S100B蛋白表达情况 对照组大鼠神经胶质细胞突起和胞体中均匀分布S100B阳性细胞；S100B蛋白表达量为79.93±0.82。击打后30 min组大鼠细胞结构破坏，突起消失；S100B蛋白表达量为85.04±0.76，明显高于对照组(P<0.01)。之后大鼠脑干组织S100B蛋白表达随着击打后时间的延伸逐渐升高，于击打后24 h达到峰值98.53±0.81，明显高于对照组(P<0.01)。击打后48 h大鼠脑干组织S100B蛋白表达量87.84±1.07，与击打后24 h相比有所降低，但仍明显高于对照组(P<0.01)。击打后72 h大鼠脑干组织S100B蛋白表达量80.03±0.95，与对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)，细胞体积逐渐增大到正常范围，可见细胞核。见图2。

2.4 各组胶质纤维酸性蛋白表达情况 对照组大鼠神经胶质细胞突起和胞体中分布胶质纤维酸性蛋白阳性细胞，胞体较小，突起细长，胶质纤维酸性蛋白表达量为31.62±0.57。击打后30 min组大鼠部分细胞形态不规则，见图3，胶质纤维酸性蛋白表达量为36.11±0.54，明显高于对照组(P<0.01)。击打后2 h组大鼠细胞突起染色加深，胶质纤维酸性蛋白表达量为37.94±0.68，明显高于对照组(P<0.01)。随时间延长其表达量逐渐上升，击打后48 h达到峰值47.30±0.65，明显高于对照组(P<0.01)，细胞形态不规则，胞质颜色加深，突起增多。击打后72 h胶质纤维酸性蛋白表达量为45.73±0.39，仍明显高于对照组(P<0.05)。

图2 大鼠脑干组织中S100B蛋白表达情况(DAB，×400)

图3 大鼠脑干组织中胶质纤维酸性蛋白表达情况(DAB，×400)

3 讨 论

中枢神经系统中星形胶质细胞是数量最多的支持细胞，在日常神经生理活动、神经组织再生及免疫、多种神经疾病的发病中发挥重要作用〔2〕。S100B是一类低分子量的钙离子结合蛋白，主要由星形胶质细胞、少突胶质细胞分泌，具有多种活性，可作为星形胶质细胞激活的重要标志物，能够提升神经胶质细胞和神经元中Ca2+浓度〔3〕。相关研究显示，S100B蛋白可经类似旁分泌作用促进神经生长；在损伤反应中表达量明显提升，与损失时间及程度呈相关性〔4〕。胶质纤维酸性蛋白是一种中间丝状蛋白，由星形胶质细胞特异性表达，可作为星形胶质细胞和其癌变的特异性标志物〔5〕。细胞数量、体积及分支增加，胶质纤维酸性蛋白表达提升是星形胶质细胞反应的标志〔6〕，因此其增殖水平及脑干损伤后病变程度能够用胶质纤维酸性蛋白表达水平来评价。

本研究显示，大鼠脑干损伤后30 min内，S100B蛋白与胶质纤维酸性蛋白表达量开始增加，此时表达量增加可能为星形胶质细胞反应性肥大而非增生，撞击损伤了大鼠脑干神经的星状胶质细胞结构，S100B蛋白与胶质纤维酸性蛋白从胞内漏出而导致表达量上升。随着时间延伸，脑干损伤反应程度不断提升，到24～48 h达到损伤反应的峰值，之后神经胶质细胞自我修复和再生能力不断加强，相应的损伤反应逐渐减弱，S100B蛋白和胶质纤维酸性蛋白的表达量下降，直至修复完成。综上所述，原发性脑干损伤后S100B蛋白和胶质纤维酸性蛋白表达随时间呈明显变化规律，以上两项指标联合分析有助于判断患者脑干损伤较为精确的时间，采取有针对性的治疗方案，改善治疗预后。

1 Yan H，Zhang HW，Wu QL,etal.Increased leakage of brain antigens after traumatic brain injury and effect of immune tolerance induced by cells on traumatic brain injury〔J〕.Chin Med J，2012；125(9)：1618-26.

2 刘 涛，何晓光，刘佰运，等.326例急性闭合性重型颅脑创伤早期死亡分析〔J〕.中华神经外科杂志，2010；26(8)：731-3.

3 Cheng TY，Chen MH，Chang WH，etal.Neural stem cells encapsulated in a functionalized self-assembling peptide hydrogel for brain tissue engineering〔J〕.Biomaterials，2013；34(8)：2005-16.

4 Guan J，Zhu Z，Zhao RC，etal.Transplantation of human mesenchymal stem cells loaded on collagen scaffolds for the treatment of traumatic brain injury in rats〔J〕.Biomaterials，2013；34(24)：5937-46.

5 黄效东.奥拉西坦治疗老年重型颅脑损伤患者的疗效〔J〕.中国老年学杂志，2012；32(10)：2159-60.

6 Kanoto M，Hosoya T，Toyoguchi Y，etal.Brain stem and cerebellar atrophy in chronic progressive neuro-Behet's disease〔J〕.Eur J Radiol，2013；82(1)：146-50.

〔2016-04-18修回〕

(编辑 郭 菁)

吉林省教育厅“十二五”科技研究项目(2013336)

曹红十(1977-)，女，副主任护师，主要从事临床护理药理学研究。

张丽勇(1974-)，女，硕士，副教授，主要从事临床生理学研究。

R651.1

A

1005-9202(2016)22-5504-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.005

1 吉林大学第一医院