缺血性神经元死亡形式及其相关信号转导通路研究进展*

乌林哈德，石瑞丽

(包头医学院生理教研室，内蒙古 包头014060)



缺血性神经元死亡形式及其相关信号转导通路研究进展*

乌林哈德，石瑞丽

(包头医学院生理教研室，内蒙古 包头014060)

缺血性脑卒中是大脑的某个区域血流量突然减少或血液循环出现障碍，包括血栓形成和相对血流灌注不足，导致相应的神经功能失活。通常缺血几秒到数分钟内，缺血应激模式启动，随后发生一系列生化反应，最终导致梗塞中心的细胞膜崩解直至神经元死亡。神经细胞死亡过程涉及复杂的时间和空间级联反应，细胞自噬(autophagy)、凋亡(apoptosis)和程序性坏死(necroptosis)这几种不同的细胞死亡形式通常相互诱导。

1细胞自噬

细胞自噬是指自噬前体结构不断延伸成双膜囊泡，包裹一些受损蛋白或细胞器，形成自噬体后与酸性溶酶体融合，将内吞的胞质物质降解以重新利用的过程。微管相关蛋白(microtubule-associated protein light chain 3, LC3)和自噬基因Beclin1均参与自噬体形成，Beclin1是参与自噬调控的重要基因，而LC3在自噬形成时由LC3-Ⅰ与磷脂酰乙醇胺结合转变为LC3-Ⅱ。

1.1细胞自噬与脑缺血生理情况下细胞自噬主要维持细胞内稳态，但自噬不足或过剩都会导致细胞死亡，自噬程度是细胞存亡的关键。应用改良Levine/Vannucci小鼠缺氧缺血模型研究发现，神经元中出现细胞色素C和凋亡诱导因子的释放以及半胱氨酸天冬酶-8(caspase-8)和半胱氨酸天冬酶-9(caspase-9)的裂解，而作为各种凋亡通路最终调节因子的半胱氨酸天冬酶-3(caspase-3)并未被激活，进一步的电镜观察发现，受损的神经元并没有表现出凋亡、坏死等形态学特征，相反却出现了大量自噬小体[1]。在体外氧糖剥夺/再灌注细胞模型中发现，LC3和Beclin1表达明显增加，用Fluoro-Jade C荧光和电子显微镜观察到复氧后的神经元死亡比率很高，加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)，细胞死亡率显著减少[2]。观察新生大鼠不同时间点缺氧缺血性损伤后细胞自噬相关蛋白LC3和Beclin-1的变化，发现海马组织中的Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白质表达水平在0 h后开始增加，24 h后达到峰值，随后开始下降，并且在所有时间点内，Beclin-1和LC3-Ⅱ的表达明显高于假手术组，低于自噬诱导剂处理组[3]。研究发现[4]，脑缺血再灌注损伤导致脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cell, BMVEC)发生自噬，从而减少血脑屏障的破坏。通过体外培养BMVEC细胞并模拟大脑缺血再灌注损伤模型，分别提前0.5 h给予自噬抑制剂3-MA和自噬诱导剂哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)，发现3-MA明显加剧BMVEC凋亡，而且升高活性氧水平。

细胞自噬作用与脑缺血后的时间有相关性。脑缺血后使用自噬诱导剂mTOR进行再灌注，可能会减弱自噬的神经保护作用，相反，在再灌注前使用3-MA会发现梗死面积明显减少，并且阻断了脑水肿的进展[5]。研究高压氧对脑缺血保护作用时发现，提前侧脑室注射3-MA再灌注后明显减弱高压氧对脑缺血保护作用。而在大脑中动脉闭塞前给3-MA处理会加重脑损伤，使用mTOR处理可观察到LC3-Ⅱ和Beclin基因表达上调，出现与高压氧预处理相似的神经保护作用，提示高压氧预处理可能增加细胞自噬[6]。

1.2mTOR信号通路与细胞自噬细胞自噬涉及多种信号通路，主要包括mTOR信号通路、磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(phosphoimsitide-3 killase/serine-threonine kinase，PI3K/Akt)信号通路、活性氧(reactive oxygen species，ROS)信号通路和核转录因子(nuclear factor-κB，NF-κB)信号通路，其中mTOR信号通路不仅在细胞代谢，细胞生长发育和细胞存活的调节中发挥重要作用，而且在脑缺血中起着至关重要的作用。mTOR是一种存在于真核生物、进化上高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于磷脂酰肌醇激酶家族。mTOR包括两种复合物形式，分别是mTOR复合物1(mTORC1)和mTOR复合物2(mTORC2)，前者主要参与细胞自噬、细胞凋亡和能量代谢的调节，后者与细胞骨架重组有关。与自噬相关的mTORC1活性受氨基酸水平影响，而氨基酸主要由鸟苷三磷酸和丝裂原蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3)介导生成，两者活性均受亮氨酸调控。肿瘤抑制基因p53是mTOR的重要调节器，利用体外培养原代小鼠神经元细胞建立氧糖剥夺/复灌(OGD/R)损伤模型，通过使用p53抑制剂或诱导剂观察其是否对OGD/R损伤有影响。结果表明，激活p53基因会抑制mTOR的表达加剧损伤，相反，抑制p53基因表达后mTOR活性上调，细胞损伤减轻[7]。

研究发现，自噬可能会在脑缺血中被中断。许多神经变性疾病的一个共同的特征是大量异常的自噬体或自噬溶酶体堆积，或是不规则的自噬小体频繁出现。可能有两种原因：第一种是自噬信号和自噬流增加，因此检测到自噬的各个水平的标记物增加；第二种情况是自噬信号本身没有变化，而是由于自噬小泡不能被溶酶体降解，而使得自噬小泡积累或是溶酶体出现功能障碍[8]。因此通常检测自噬发生，除了需要检测LC3是否有增加，还需要加上氯喹或者蛋白酶抑制剂等化合物阻断溶酶体的降解途径，观察LC3是否增加更加明显。

2细胞凋亡

细胞凋亡是脑缺血时细胞死亡的另一种重要方式，也称为程序性死亡，是脑缺血后神经功能缺损的主要原因之一。细胞凋亡发生迅速，其特征主要有核染色质固缩成片段，细胞器皱缩和内质网的膨胀等。凋亡细胞通常与其相邻细胞脱离，胞膜有小泡形成，将凋亡细胞残骸分割包裹为凋亡小体，凋亡小体的质膜保持完整性防止细胞质泄漏引发炎症反应。

2.1细胞凋亡与脑缺血 缺血性脑卒中发生早期，缺血中心区脑血流急剧下降发生能量代谢障碍，神经细胞死亡以坏死为主；而缺血中心区周围(缺血半暗带)的神经细胞在周边血流供应下仍然具有代谢活力，其后续的死亡形式以凋亡为主。在大鼠大脑中动脉局灶缺血模型中[9]，活化的半胱天冬蛋白酶可同时介导细胞内和细胞外两条凋亡信号转导通路，外源性途径(又称细胞死亡受体途径)是通过活化的自杀基因(factor associated suicid，Fas)受体与配体(Fas ligand，Fas-L)结合后被启动，在缺血半暗带可观察caspase-1、caspase-3、caspase-8、caspase-9以及裂解的caspase-8表达增加。内源性途径(又称线粒体途径)激活是指促凋亡蛋白Bax或Bcl-2家族其他成员易位到线粒体膜上形成线粒体跨膜通道，从而引起凋亡诱导因子细胞色素C的释放，细胞色素C通过凋亡酶激活因子(apoptotic protease activating facter-1，Apaf-1)的多聚化与caspases-9形成凋亡小体，而Bcl-2过度表达会减少梗死面积。caspase-8和caspase-9激活caspase-3后进而切割其它关键底物，包括将DNA修复酶聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)切割成89 kDa和28 kDa的片段。相反，抑制caspase-3会缩小梗死面积，减少脑损伤。另外，caspase-8可以裂解Bcl-2家族中的Bid，裂解后的片段易位至线粒体上，增加细胞色素C的释放能力。另有数据显示线粒体是氧化应激引起细胞凋亡的重要通路。发生脑缺血时线粒体能量代谢产生障碍，能量合成受阻，导致神经元死亡。研究发现，用氰化物对大鼠皮质神经细胞进行氧糖剥夺后，还原型辅酶Ⅰ(nicotinamide adenine dinucleotide hydrogen，NADH)和还原型辅酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate hydrogen，NADPH)的含量减少，恢复氧糖供应后，NADH和NADPH的含量有所增加，提示线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeablity transition pore，mPTP)促进NAD(H)释放，同时PARP被激活使NADP(H)发生降解[10]。细胞ATP逐渐耗尽，依靠ATP运转的离子泵活性受阻，导致细胞内钙离子和钠离子超载，使线粒体肿胀和线粒体外膜破裂，引起迟发性细胞损伤。

2.2丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信号通路与细胞凋亡细胞凋亡机制复杂，有多种信号转导通路参与介导，主要包括线粒体通路、死亡受体通路和内质网通路，内质网通路又包括内质网前凋亡因子CHOP通路、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal Kinase，JNK)通路和caspase通路。JNK和p38MAPK都属于MAPKs，是细胞内的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞调亡过程中具有至关重要的作用，可被不同生长因子和G-蛋白偶联受体激活，脑卒中后通过激活细胞促炎和促凋亡信号加中脑损伤。脑缺血时活化的JNK转移至细胞核内并使其下游作用底物c-Jun磷酸化，促进线粒体中细胞色素C向胞浆释放，进而激活线粒体凋亡信号通路；p38MAPK是MAPK的苏氨酸和酪氨酸残基的特定位置发生双重磷酸化而被激活，p38MAPK可通过增强Fas/Fas-L的表达促进细胞凋亡[11]，并介导炎症反应。体外培养小胶质细胞及建立氧糖剥夺模型发现，p38MAPK可激活小胶质细胞，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF-α)和白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)表达增加。小鼠MCAO模型中，敲除小鼠的丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶(Mitogen activated protein kinase phosphatase-1，MKP-1)基因和使用MKP-1抑制剂后发现，JNK和小胶质细胞中p38MAPK被激活，脑梗塞增加，导致神经功能障碍和出血量增多，提示MKP-1可使MAPKs快速发生去磷酸化，抑制其活性[12]。

3程序性细胞坏死

长期以来，细胞坏死被认为是一种不受控制的被动死亡方式，但是越来越多的研究表明细胞坏死并不是完全不受调控的、被动的死亡方式，在某些情况下，可以通过信号转导通路进行且不依赖caspase激活。2005年Degterev等提出了“程序性细胞坏死”的概念[13]，这种死亡细胞与传统坏死细胞具有相似的形态学特点，表现为细胞质肿胀，细胞膜破裂，内容物释放，但程序性细胞坏死伴有自噬现象。程序性细胞坏死主要由受体相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1，RIPK1)和受体相互作用蛋白激酶3(receptor-interacting protein kinase 3，RIPK3)控制，RIP1和RIP3有一段特殊的蛋白相互作用区域，促进RIP1与RIP3相互作用,使两者相互磷酸化形成坏死复合物[14]。研究表明，程序性细胞坏死在许多疾病模型中加剧病理性损伤。

3.1程序性细胞坏死与脑缺血脑缺血发生后，缺血中心区的细胞由于血流中断能量代谢障碍，发生坏死，在细胞形态还未发生明显变化时开始产生活性氧，当细胞膜破裂时，产生的活性氧达峰值，大量的活性氧激活NF-κB，使其产生细胞炎症因子，增加活性氧的毒性和兴奋性，促进缺血神经元的变性，同时细胞内容物泄漏引起炎症反应，加重脑损伤。

3.2TNF-α受体介导信号通路与程序性坏死当中枢神经系统受到各种刺激，包括感染和损伤时，活化的小神经胶质细胞和星形胶质细胞可以产生TNF-α，是介导程序性细胞死亡的主要信号通路，发生过程是TNF-α与受结合后诱导复合蛋白物I形成，进一步在胞质内形成蛋白复合物Ⅱ，后者是死亡诱导信号复合物，蛋白复合物2包括去泛化素化的PIP1和caspase-8，当caspase-8活性受抑制时，RIPl/RIP3被磷酸化，磷酸化的RIPl/RIP3及RIP3下游因子形成复合物Ⅱb，即坏死小体(necrosome)，最终诱导细胞坏死。虽然DNA修复酶PARP已被证明是TNF-α介导程序性细胞坏死的一个关键因素。但有实验证明[15]，TNF-α和PARP通路所诱导的程序性细胞坏死并不完全相同。首先，DNA的烷基化剂如1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(1-Methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidine，MNNG)或甲磺酸甲酯会迅速激活PARP途径，而在TNF诱导细胞坏死过程中较晚才发生。第二，抑制PARP通路对TNF诱导的细胞坏死没有保护作用，如PARP-1抑制剂3-氨基苯酰胺(3-Aminobenzamide，3-AB)可以抑制MNNG，对TNF-α引起的5’-三磷酸腺苷耗竭、凋亡诱导因子易位和细胞坏死没有影响。第三，用神经酰胺干扰TNF-α诱导细胞凋亡，但没有阻止RIP1或RIP3功能或自由基清除剂丁基羟基苯甲醚PARP引发程序性细胞坏死。

4自噬、凋亡和坏死的关系

目前，对细胞自噬、凋亡和坏死之间的具体联系和相互作用没有完全明确，但现有大量证据显示，凋亡可以改变自噬。如果自噬无法维持细胞存活，则细胞可以通过激活细胞凋亡途径以确保它们得到有效控制和消除，避免发生炎症反应。因此，自噬和凋亡(反之亦然)之间的调节关系可以表示为细胞进化优势。细胞自噬和凋亡从根本上有着明确不同的生物化学和形态特征，但是它们的调节和执行蛋白是紧密相连。凋亡和自噬既可以相互抑制又可以相互诱导。自噬减少细胞凋亡发生的主要机制是发生线粒体自噬。在细胞死亡过程中，外膜蛋白会引起线粒体代谢水解酶的释放和膜电位的消失，引起生物能紊乱。但是一些在自噬中起重要作用的蛋白质也可能是促凋亡因子，例如自噬相关基因ATG12(autophagy related gene 12)和ATG5(autophagy related gene 15)是形成自噬体的重要蛋白质，但同时也是激活细胞凋亡的信号因子[16]。程序性细胞坏死与凋亡均是由死亡受体介导的两种不同的细胞死亡方式，但程序性细胞坏死既不依赖于caspase，也不需线粒体释放细胞色素C，细胞在caspase活性被抑制而不能发生凋亡的情况下才会启动程序性坏死，RIPK3是引起程序性细胞坏死必不可少的因素，也是调控caspase-8是否活化激活细胞凋亡级联反应的关键。

综上所述，脑缺血损伤后神经元的死亡是一个多途径、多因素的复杂病理过程，虽然自噬、程序性坏死、凋亡都被激活，但呈现不同的时程变化，发挥的作用也不尽相同。某些作用于信号转导通路的药物已被证实对缺血性脑损伤发挥了良好的保护作用。因此，更加透彻地阐明各种死亡形式的作用机制，对于阻碍脑缺血损伤后神经元的死亡，寻找新的药物治疗靶点，筛选优秀的抗脑缺血药物具有重要的理论和现实意义。

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*基金项目：国家自然科学基金资助项目(No 81450058)；内蒙古自治区自然科学基金项目(No 2013MS1108)

通讯作者：石瑞丽

(收稿日期：2015-06-15)