piggyBac转座子在畜牧兽医科学中应用研究进展

林丽梅　周世业　白丁平

（1.福建农林大学动物科学学院　福州　350002；2.国家水禽品种资源基因库　福建石狮　362700）

piggyBac转座子在畜牧兽医科学中应用研究进展

林丽梅1周世业2白丁平*

（1.福建农林大学动物科学学院福州350002；2.国家水禽品种资源基因库福建石狮362700）

piggyBac（PB）转座子已被证明是一种高效的非病毒基因工程操作工具，现广泛用于基因操作和转基因动物研究中。借助PB转座子已获得转基因小鼠、鸡、猪、山羊等动物。文中重点就PB转座子在畜牧兽医科学研究中的应用进行综述。

piggyBac转座子基因工程转基因动物

PB转座子是一种非病毒转基因载体，可携带外源基因整合到宿主染色体上并实现长期稳定表达。鉴于PB转座子整合外源基因的这一优势，PB转座子在昆虫［1-2］、寄生虫［3-4］和鱼类［5-6］等低等生物中得到了广泛应用。2005年Ding等［7］将PB转座子应用于人和小鼠细胞的基因功能研究，实现了外源基因在哺乳动物细胞中的稳定表达，并首次用PB转座子获得转基因小鼠，从而证实PB转座子可用于哺乳动物基因工程研究。目前，PB转座子的应用范围进一步扩大，在畜牧兽医科学研究中得到广泛应用。

1　牛研究中应用

将PB转座子应用到牛的研究中，探索其在牛基因组中转座效率和整合特性具有十分重要的意义。杜新华等［8］利用PB转座子在牛基因组中获得了8个有效整合位点，其中5个整合位点定位到牛1、2、11和X染色体上。该研究发现在牛基因组中PB转座子5′端倾向于整合到富含GC（62.5%）碱基富集区。白宏伟等［9］研究发现PB转座子可明显提高牛成纤维细胞的转染效率，获得更多转基因单克隆细胞。他们在牛基因组中研究获得40个PB转座子整合位点，可定位到牛的14条染色体上。由此说明PB转座子在牛基因组具有高效转座能力。

生产转基因牛的关键步骤是获得转基因供体细胞和制备转基因重构胚胎。杨宁等［10］构建了以PB转座子为载体元件，增强绿色荧光蛋白（EGFP）为报告基因，新霉素（NEO）为抗性基因，alpha-肌动蛋白为启动子的A-FABP基因特异性表达载体pPBAFABP。通过转染试验获得表达目标基因A-FABP的牛成纤维细胞。Su Jin KIM等［11］借助PB转座子将绿色蛋白（GFP）和红色荧光蛋白（RFP）转入到供体成纤维细胞中，然后通过体细胞核移植（SCNT）制备获得牛转基因重构胚胎，并在重构胚胎中实现了GFP和RFP稳定表达。以上研究表明PB转座子可用于牛的转基因生产中。

多潜能胚胎干细胞（ES）是开展基因敲除和基因沉默的重要工具，借助有效的技术手段获得ES细胞成为当前研究热点。研究已证实在成纤维细胞中导入Oct 4、Sox 2、Klf4和Myc四个基因，通过体细胞重编程可获得诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS cells），iPS细胞与ES细胞具有相似的形态和功能［12］。赵丽霞等［13］借助PB转座子用鼠源的6个基因（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Rarg、Lrh1）诱导胎牛成纤维细胞，获得了牛的iPS细胞，通过RT-PCR和免疫组化技术鉴定发现表达多能性基因，证实利用PB转座子可获得牛iPS细胞。

2　马研究中应用

马在博彩业、娱乐业和体育竞技中具有其他动物不可替代的角色。在此类项目中马也容易患运动损伤性疾病，从而影响优良马匹的使用寿命。因此获得有效的治疗肌肉、腱、韧带和关节等运动损伤疾病的方法，对延长马匹使用寿命具有重要意义。Nagy等［14］使用PB转座子将转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc转入到马成纤维细胞中获得iPS细胞。利用免疫组化和RT-PCR检测发现表达多潜能特异性标志基因Oct4、Nanog、SSEA1、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81，结果与其他动物细胞诱导获得的iPS细胞类似。本研究为将来利用iPS细胞治疗马的疾病开拓了新途径。

3　猪研究中应用

猪是一种重要的农业经济动物，对保障人类肉食品安全供应有重要作用。因此利用基因工程技术提高其生产力、增强抗病力具有重要意义的。Clark等［15］利用PB转座子转染猪子宫内膜腺上皮细胞时发现，与无转座子的随机插入方法相比较，PB转座子可使转基因细胞克隆数提高28倍。Clark等借助PB转座子也成功获得了转基因猪。Zhenfang Wu等［16］用转座子载体pB-CMV-neo-EGFP和转座酶载体mPBase共转染猪胎儿产纤维细胞，通过G418筛选得到表达EGFP的转基因细胞，随后用SCNT技术获得了表达EGFP的转基因猪后代。Zicong Li等［17］利用细胞质注射方法 （Cytoplasmic Injection，CTI），将PB转座子载体pmGENIE-3-EGFP注射入猪胚胎细胞质中，也获得了表达EGFP的转基因仔猪。证明PB转座子是生产转基因猪的一种有效工具。

4　绒山羊研究中应用

绒山羊主要饲养在生态脆弱的地区，减少饲养数量、提高产绒量一直是绒山羊育种的主要方向。应用转基因技术是提高绒山羊产绒量和羊绒品质的重要手段之一。何晓琳等［18］从陕北白绒山羊皮肤中克隆获得FGF5s基因，构建了表达FGF5s基因的PB转座子载体，通过细胞转染和嘌呤霉素筛选获得稳定表达FGF5s基因的转基因细胞。白丁平等［19］利用反向PCR在绒山羊基因组中检测到21个整合位点，整合位点TTAA毗邻一侧的5个碱基组成中，3′倾向于整合到富含AT（58.35%）碱基区，5′倾向于整合到富含GC（57.8%）碱基区。以上研究可为PB转座子在绒山羊基因工程中应用提供理论参考。

5　家禽研究中应用

PB转座子在家禽中也开展了一系列有意义的探索。新城疫病毒是一类养禽业危害极大的接触性传染病。唐文雅等［20］构建了新城疫病毒V基因PB转座子供体质粒pTKL1-CMV-Puro-EGFP，与辅助质粒mPB共转染鸡胚成纤维细胞系（DF-1），获得了稳定表达新城疫病毒V蛋白的DF-1细胞系。为PB转座子在家禽细胞中的应用提供了参考。维甲酸诱导基因-I（retinoic acid inducible gene-I，RIG-I）通过特异识别并结合病毒RNA而发挥抗病毒作用。鸭和鹅体内含有RIG-I受体，而鸡体内未发现RIG-I受体。胡跃等［21］借助PB转座子将鹅的RIG-I转染到DF-1中，获得了稳定表达鹅RIG-I的DF-1细胞系。获得的表达RIG-I基因细胞系可用于研究鸡先天性免疫机制。

利用PB转座子也获得了转基因鸡。Liu Xiaojuan等［22］利用显微注射法将转座子质粒ZGl-neo和转座酶质粒CAG-PBase按3:1比例显微注射到鸡胚的胚盘下腔，经电融合获得转基因胚胎，随后用二次换蛋壳法制备获得转基因个体。检测10羽雄性转基因个体时发现，40%的雄鸡精液呈转基因阳性，表达GFP标记基因。Jordan B J等［23］检测利用PB转座子获得的转GFP基因鸡时发现，在鸡的心脏、脑、肝、肠、肾和性腺等组织中GFP均稳定表达。Park TS等［24］用表达 GFP的转座子转染鸡原始生殖细胞（primordial germ-cell，PGC），经G418筛选获得转基因细胞。随后将受体鸡蛋开一小孔，利用显微注射法将超过1 000个携带GFP的PGC注入到受体胚胎背主动脉中，然后用石蜡封闭蛋壳，按常规方法对受体鸡蛋进行孵化，也获得表达GFP转基因鸡后代。

6　总结与展望

PB转座子作为一种非病毒基因工程载体，无潜在的遗传毒性，在遗传操作中相对安全。利用PB转座子高效整合外源基因和转座能力，可携带外源基因对动物疾病进行靶向治疗。PB转座子同时也是一种高效的基因诱变工具，利用它使目标基因诱变失活，从而确定该基因功能。总之，随着分子生物学技术的发展，应用PB转座子对推动畜禽基因组功能研究、疾病治疗，培育家畜和家禽新品种等方面具有重要意义。

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Research development of piggyBac transposon in animal husbandry and veterinary science

Lin Limei1Zhou Shiye2Bai Dingping1*
（1.College of Animal Science，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002；2.Gene Pool of Waterfowl Resources，Shishi Fujian 362700）

The non-viral piggybac（PB）transposon system has proven to be an effective tool of research with genetic manipulation and transgenic animal.Transgenic animals of mice，chickens，pig，and goat have obtained by PB transposon.The current review focused on the application of PB transposon in animal husbandry and veterinary sciences.

piggyback transposon genetic engineering transgenic animal

A

1003-4331（2016）04-0029-03

福建省教育厅中青年教育科研项目（JA13109）、福建省自然科学基金项目（2015J01076）资助。

林丽梅（1994-），女，本科生，动物科学专业。E-mail:1009174137@qq.com。
*

白丁平（1976-），男，讲师，博士。研究方向为动物遗传育种与繁殖，E-mail:bdpnx@163.com。