双重实时荧光RT-PCR法检测肠道病毒方法的建立及应用*

许联红，岳玉林，王永仿，楚 鹰，蒋立新

(1.江苏大学附属武进医院检验科,江苏常州 213002；2.江苏省南京市儿童医院检验科 210008)



双重实时荧光RT-PCR法检测肠道病毒方法的建立及应用*

许联红1，岳玉林2，王永仿1，楚 鹰1，蒋立新1

(1.江苏大学附属武进医院检验科,江苏常州 213002；2.江苏省南京市儿童医院检验科 210008)

目的 建立检测肠道病毒(EV)和肠道病毒71型(EV71)的双重实时荧光RT-PCR法。方法 设计特异性引物和探针，建立双重实时荧光RT-PCR反应体系，绘制标准曲线，对该方法的灵敏度、精密度等进行评价。收集109例临床手足口病患者粪便和咽拭子标本用该法进行检测，并与EV71商品化试剂盒检测结果进行比较。结果 双重荧光PCR法建立的EV和EV71标准曲线相关系数(r)均为0.998；该法检测EV和EV71的灵敏度分别达到0.5 TCID50/mL和0.05 TCID50/mL；检测EV和EV71的批内精密度均小于3%，总精密度均小于或等于4%；对肠道病毒及其他人类非肠道病毒进行检测，显示了良好的特异性。109例临床样本用该法检测出84例EV病毒阳性样本，其中EV71阳性56例，EV71总阳性率为51.4%；与单重荧光PCR商品化试剂盒的检测结果完全一致(P=1.000)。结论 建立的双重实时荧光RT-PCR法灵敏度高、稳定性好，对手足口病的早期高通量快速诊断具有重要意义。

手足口病；肠道病毒；肠道病毒71型；双重实时荧光RT-PCR

手足口病(HFMD)是一种急性传染病，由多种肠道病毒引起，多发生于5岁以下儿童，主要通过密切接触或消化道传播，基本临床表现为手、足、口腔等部位出现疱疹，部分患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等多种与神经系统相关的疾病[1]。个别重症患儿病情发展很快，最终可能导致死亡。引发HFMD的20多种肠道病毒中以EV71型最为常见。1969年Schmidt等[2]首次从加利福尼亚州患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出肠道病毒71型，属于小RNA病毒科肠道病毒属。EV71病毒主要通过粪-口传播，且隐性感染者居多，因此易出现暴发流行[3-4]。该病已被我国定为乙类传染病。快速、简便、高敏感性的检测方法对该病的预防控制极其重要。传统的病毒分离培养、血清学方法等，步骤繁琐，灵敏度不高，容易出现漏检。本试验拟通过建立一种双重实时荧光RT-PCR方法，在完全闭管的条件下同步检测通用型肠道病毒(enterovirus,EV)和EV71病毒，为临床HFMD患者的早期诊断提供一种有效、快速的检测手段。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2014年3月至2015年8月南京市儿童医院住院HFMD患儿的109份治疗前标本(粪便标本64份和咽拭子45份)。HFMD诊断标准参考中华人民共和国卫生部制定的2010年版《手足口病诊疗指南》。EV71/FY0805和EV71/BrCr病毒株由南京大学公共卫生中心实验室提供。

1.2 仪器与试剂 病毒核酸提取试剂盒(江苏硕世公司)，一步法荧光定量RT-PCR试剂盒(大连宝生物公司)，ABI7500荧光PCR仪(美国ABI公司)，肠道病毒71型核酸检测试剂盒(中山大学达安基因公司)。

根据EV71的VP1区核酸序列和EV的5′UTR区核酸序列，用Primer Express3.0软件设计特异性引物与TaqMan 探针，并对其进行BLAST 序列比对，验证引物和探针的特异性。引物和探针序列见表1，均由上海生物工程公司合成。

表1 引物和探针序列

1.3 方法

1.3.1 病毒核酸的提取 粪便标本须加入适量生理盐水(0.5 g粪便或0.5 mL液态粪便样本加5 mL生理盐水)，然后将悬液12 000 r/min离心10 min，取200 μL上清液进行RNA抽提；咽拭子标本中加入1 mL生理盐水充分搅动10次，取200 μL提取RNA；病毒细胞培养物直接取200 μL培养液用于抽提RNA。取上述各种标本200 μL于1.5 mL离心管中，加入600 μL 裂解液，震荡混匀，室温放置5 min；加入600 μL缓冲液震荡混匀，混合液转移至吸附柱中，12 000 r/min离心1 min，去掉废液，重复此操作直至转移完；加入500 μL漂洗液，12 000 r/min离心1 min，去掉废液，重复漂洗1次；12 000 r/min空柱离心2 min；将吸附柱放入1个干净的1.5 mL离心管中，加入50 μL洗脱液静置5 min，12 000 r/min离心1 min收获纯化的核酸溶液，-80 ℃冰箱保存备用。

1.3.2 双重荧光RT-PCR检测方法的建立 反应体系：2×PCR 缓冲液12.5 μL，5 U/μL Ex Taq酶0.5 μL，5 U/μL 逆转录酶(M-MLV)0.5 μL，20 μmol /L 上、下游引物各0.5 μL，10 μmol /L探针0.5 μL，总RNA 5 μL，DEPC水补足至25 μL。扩增条件:50 ℃ 30 min; 95 ℃ 5 min; 95 ℃ 10 s,55 ℃ 35 s，共45个循环，在55 ℃进行双重荧光信号检测。

1.3.3 双重荧光RT-PCR法的灵敏度检测 将EV71/FY0805病毒株培养液(病毒滴度为5×105TCID50/mL)10倍连续稀释(5～0.005 TCID50/mL)，提取病毒RNA，按上述条件进行荧光定量RT-PCR，每个稀释标本重复检测10次。

1.3.4 双重荧光RT-PCR法的精密度检测 每天分析1个批次，2个浓度样本(5×102和0.5 TCID50/mL)，每个样本重复测定3 次，连续检测5 d。参照文献[5]计算批内精密度(CV批内)和总精密度(CV总)。

1.3.5 双重荧光RT-PCR法的特异度检测 应用双重荧光RT-PCR法分别检测EV71病毒株、柯萨奇病毒A16、埃可病毒、轮状病毒和流感病毒。

1.3.6 双重荧光RT-PCR法的临床应用 应用双重荧光RT-PCR法检测收集的109例HFMD患者粪便和咽拭子样品，并与肠道病毒71型核酸检测试剂盒检测结果进行比较。

1.4 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行统计分析，计数资料用四格表资料的χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 EV和EV71标准曲线建立 将EV71/FY0805病毒株培养液以10倍连续稀释，提取病毒中的核酸(RNA)作为模板，按上述条件进行双重实时荧光RT-PCR反应，分别得到相应荧光信号的EV和EV71特异性扩增曲线，见图1。然后建立相对定量标准曲线，其中横坐标为病毒滴度的log值，纵坐标为RT-PCR循环的Ct值，EV和EV71标准曲线的相关系数(r)均为0.998，见图2。

EV71扩增曲线(a:5×104TCID50/mL,b:5×103TCID50/mL,c:5×102TCID50/mL,d:50TCID50/mL)。EV扩增曲线(e:5×104TCID50/mL,f:5×103TCID50/mL,g:5×102TCID50/mL,h:50TCID50/mL)。

图1 EV和EV71双重荧光PCR扩增曲线图

图2 EV71和EV标准曲线的建立

2.2 双重荧光RT-PCR法的灵敏度 当病毒滴度为5和0.5TCID50/mL时，10次EV和EV71均能检出；当滴度为0.05 TCID50/mL时，10次中有2次EV未检出，EV71全部检出；而当滴度为0.005 TCID50/mL时，EV均未检出， EV71有1次未检出。因此该方法检测EV和EV71的灵敏度分别为0.5和0.05 TCID50/mL。

2.3 双重荧光RT-PCR法的精密度 病毒滴度为5×102TCID50/mL时，EV71和EV检测所获得的Ct值批内精密度(CV批内)分别为2.1%和2.4%，总精密度(CV总)均为3.9%；病毒滴度为 0.5 TCID50/mL时，EV71和EV的批内精密度分别为2.7%和2.6%，总精密度分别为4.0%和3.5%，见表2。

2.4 双重荧光PCR法的特异度 EV71/FY0805 和EV71/BrCr 病毒株通用型EV和EV71检测结果均为阳性；柯萨奇病毒A16和埃可病毒EV检测阳性，EV71结果阴性；而轮状病毒和流感病毒二者皆为阴性，见表3。

表2 双重荧光RT-PCR法的精密度检测(Ct值)

表3 双重荧光PCR法的特异度检测

+：阳性；-：阴性。

2.5 双重荧光RT-PCR法的临床应用 对109份临床HFMD患者样品(其中粪便标本64份，咽拭子标本45份)利用双重荧光RT-PCR和EV71单重荧光PCR商品化试剂盒进行检测。通用型EV病毒在粪便中检出阳性52例，咽拭子中检出32例，总阳性率为77.1%(84/109)。粪便和咽拭子标本的EV71阳性率分别为56.25%(36/64)和44.4%(20/45)。双重荧光RT-PCR法和EV71荧光PCR试剂盒检测EV71总阳性率均为51.4%(56/109)，阳性和阴性符合率均为100%，检测结果完全一致(P=1.000)，见表4。

表4 双重荧光PCR法和单重荧光PCR试剂盒检测EV71的结果比较

+:阳性；-：阴性。

3 讨 论

传统的检测EV71病原体的方法有病毒分离培养、血清学方法和RT-PCR等。病毒分离培养是手足口病感染的实验室诊断金标准，但对实验室条件和操作人员技术要求严格，培养周期长，各个实验室分离阳性率不同，病毒流行期间，不能同时处理大量样本[6-7]。中和抗体检测费时、费力，无法满足快速、早期诊断的要求。酶联免疫吸附试验(ELISA)法可以检测相应病毒特异性IgM抗体，操作简便、特异、准确，适用于早期检测，但在检测低水平抗体时易出现假阴性，报道称其和RT-PCR方法联合检测有助于提高HFMD的早期诊断[8-10]。病原微生物检测已开始广泛使用分子生物学技术，普通的RT-PCR技术虽然克服了以上缺点，已经成为快速诊断的重要手段，但PCR后需进行凝胶电泳分析，且系统开放，容易受环境因素发生交叉污染，造成假阳性，对疾病的诊断造成误诊[11-12]。

本研究建立的双重实时荧光RT-PCR检测方法，利用TaqMan技术，改善了单重荧光定量RT-PCR耗时长，成本高和多重高通量RT-PCR易发生污染、灵敏度和特异性较低的不足[13]。该检测方法能在一个反应管中灵敏、特异地检测并区分EV和EV71。EV71属于EV 的一个亚型，利用RT-PCR 检测EV71时，理论上不仅仅特异性的EV71探针应该呈现阳性曲线，EV 的通用型EV 探针也应该呈现阳性曲线，最后结果应该显示为双阳性曲线。若是在检测EV71时仅仅只有特异性EV71 探针显示阳性而EV探针显示为阴性时，则该样本需重新进行检测。而对于EV阳性EV71阴性的标本提示患者是由其他肠道病毒引起，为明确病因需进一步进行其他肠道病毒检测。

本研究结果显示，双重荧光PCR法建立的EV和EV71标准曲线相关系数均为0.998；检测EV和EV71的灵敏度高，分别达到0.5 TCID50/mL和0.05 TCID50/mL；重复性好，批内精密度均小于3%，总精密度均小于或等于4%；特异性检测显示只有EV71样本呈现EV和EV71双阳性曲线，其他病毒标本均未出现特异性EV71阳性曲线，表明该法特异性强。临床样本检测结果显示，双重荧光RT-PCR法通用型EV阳性检出率为77.1%，EV71总阳性率为51.4%，与EV71商品化试剂盒的检测结果完全一致(P=1.000)。以上结果表明双重荧光RT-PCR法可以对EV和EV71进行稳定可靠的检测。

本研究建立的双重实时荧光RT-PCR法检测肠道病毒快捷，灵敏度高，稳定性好，污染小，省时省力，能够有效检测手足口病患者感染的病原体，也可进行大规模流行病学调查。

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Establishment and application of dual real-time fluorescent RT-PCR method for detection of Enterovirus*

XuLianhong1,YueYulin2,ChuYing1,WangYongfang1,JiangLixin1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedWujinHospitalofJiangsuUniversity,Changzhou,Jiangsu213002,China； 2.DepartmentofClinicalLaboratory,NanjingMunicipalChildren′sHospital，Nanjing,Jiangsu210008，China)

Objective To develop a dual real-time fluorescent RT-PCR method for rapid detection of enterovirus(EV)and enterovirus type 71(EV71). Methods Specific primers and probes were designed and the dual real-time fluorescent RT-PCR reaction system was established. The quantitative standard curve was drawn; its sensitivity and precision were evaluated. Feces and throat swab specimens of 109 clinical patients with hand foot and mouth disease were collected and tested by using this method. Then the obtained results were compared with those detected by commercial EV71 PCR kit.Results The relative coefficient(2)of EV and EV71 standard curve established by the dual real-time fluorescent RT-PCR method were both 0.998. Its sensitivity reached 0.5 TCID50/mL for detecting EV and 0.05 TCID50/mL for detecting EV71. The within-run precision for detecting EV and EV71 was<3% and total precision≤4%. The results showed good specificity for the detection of enterovirus and non-enterovirus. In 109 detected clinical samples, 84 cases of EV positive samples were detected, in which 56 cases were EV71 positive with the total positive rate of 51.4%, which was consistent with the result of simple fluorescent RT-PCR commercialization kit(P=1.000).Conclusion The established dual real-time fluorescent RT-PCR method has high sensitivity and good stability, which has an important significance for early high throughput rapid diagnosis of hand foot and mouth disease.

hand foot and mouth disease; enterovirus;enterovirus71;dual real-time fluorescence RT-PCR method

�术与方法·

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.33.026

江苏省武进市科技发展计划(WS201312)。 作者简介：许联红(1981-)，硕士，主管技师，主要从事病原体分子生物学研究。

R512.5；Q93-33

A

1671-8348(2016)33-4688-03

2016-05-11

2016-07-21)