促进转移的肿瘤相关免疫细胞与靶向治疗策略

罗　琴(综述)　邵卫清　杨璐宇　余光阳　钦伦秀,△(审校)

(1复旦大学生物医学研究院　上海　200032;2复旦大学附属华山医院普外科　上海　200040;3复旦大学肿瘤转移研究所　上海　200040)



促进转移的肿瘤相关免疫细胞与靶向治疗策略

罗琴1(综述)邵卫清2,3杨璐宇2,3余光阳1钦伦秀1,2,3△(审校)

(1复旦大学生物医学研究院上海200032;2复旦大学附属华山医院普外科上海200040;3复旦大学肿瘤转移研究所上海200040)

【摘要】肿瘤转移受肿瘤细胞自身改变的累积和肿瘤微环境所共同驱动。肿瘤微环境中的免疫相关细胞,尤其是肿瘤相关巨噬细胞 (tumor-associated macrophages,TAMs)、骨髓源性抑制细胞 (myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)、调节性T细胞 (regulatory T cells,Treg)等在免疫抑制和促肿瘤转移中举足轻重。肿瘤转移经历免疫逃逸、预转移“壁龛”形成、突破血管内皮至血循环,最终转移至靶器官形成转移灶，每一个步骤都离不开肿瘤细胞与多种免疫细胞相互作用。本文就免疫相关细胞促进肿瘤转移的分子机制作一综述,并探讨靶向肿瘤转移相关免疫细胞的研究策略。

【关键词】肿瘤转移;免疫细胞;靶向转移相关免疫细胞

过去数十年,我们认为在肿瘤发生发展过程中免疫系统时刻监视肿瘤并抑制其恶性进展。然而,细胞毒性T细胞 (cytotoxic T lymphocyte,CTL)和自然杀伤细胞 (natural killer,NK)作为肿瘤免疫中重要的效应细胞,在巨噬细胞、中性粒细胞等免疫细胞辅助下,虽然确实发挥免疫监视、免疫抑制和杀伤作用,但事实上,微环境中肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用并非如此简单。在肿瘤发生过程中,炎性细胞一方面可产生活性氧 (reactive oxygen species,ROS)和活性氮中间产物 (reactive nitrogen intermediates,RNI),促进邻近上皮细胞发生基因突变; 另一方面,则通过分泌的细胞因子介导上皮细胞累积ROS和RNI,从基因层面及表观遗传学水平促进肿瘤发生。而在肿瘤发展过程中,肿瘤浸润性炎性细胞,包括调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)、巨噬细胞、树突状细胞、骨髓源性抑制细胞 (myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)等,可分泌多种细胞因子作用于癌前病变细胞,活化其NF-κB、STAT3等关键信号通路,促进恶性细胞的生存、增殖、血管新生以及浸润转移。同时,恶变的实质细胞也分泌细胞因子招募各种免疫炎性细胞,进一步形成正向循环,促进肿瘤恶性演变[1-2]。

肿瘤恶性转移是导致肿瘤低治愈率、高致死率的直接原因。明确肿瘤转移过程的分子机制,将为攻克癌症提供坚实的理论依据和指导策略。研究表明,肿瘤细胞转移至靶器官形成转移灶经历了复杂而漫长的过程。首先,肿瘤细胞通过特定机制逃避免疫监视,并分泌多种细胞因子改变靶向转移器官微环境,为其浸润转移作准备。其次,肿瘤细胞通过多种途径促进血管新生,并增加原发病灶周围微血管通透性,促进肿瘤细胞进入血液循环系统。再次,循环的肿瘤细胞通过免疫逃逸存活于血液循环,黏附于转移靶器官,并继续存活、生长,最终形成转移灶。肿瘤的恶性转移除了与肿瘤细胞自身内在改变有关,依然离不开肿瘤细胞与微环境中间质细胞之间的相互作用。尤其是肿瘤浸润性免疫炎性细胞及免疫抑制细胞等,对肿瘤细胞恶性转移至关重要。

肿瘤免疫逃逸肿瘤免疫逃逸 (immune escape)指肿瘤细胞通过特定分子机制逃避机体免疫系统识别和攻击,得以在体内存活并增殖的现象。正常情况下,NK细胞能通过肿瘤缺失的组织相容性分子(major histocompatibility molecules,MHC) I类分子激活相关配体,继而激活自身分泌免疫效应分子,如IFN-γ。因此,NK细胞和CTL细胞数目往往与肿瘤患者良好预后相关。而在肿瘤恶性进展过程中,肿瘤细胞则可以通过分泌免疫抑制分子,如TGF-β、IL-10、ROS等,抑制NK细胞和CTL细胞的募集,并改变其细胞毒性功能及膜表面受体的分布,从而抵御肿瘤的恶性进展[3]。不仅如此,肿瘤细胞也会一方面“改变自我”,另一方面“化敌为友,为我所用”。肿瘤细胞通过下调甚至缺失表达MHC、肿瘤抗原等,而“改变自我”不被免疫细胞所识别清除,从而逃避免疫监视[4]。

肿瘤细胞实现“化敌为友”主要通过转变免疫细胞的抗肿瘤活性,以促进自身生长、转移。较为常见的转换包括CD4+T细胞,从辅助杀伤性T细胞 (CD8+T细胞)作用的Th1型向抑制CD8+T细胞杀伤作用的Th2型转换,巨噬细胞从主要发挥吞噬和抗原呈递作用的M1型向促肿瘤恶性的M2型转变,以及中性粒细胞从N1型的吞噬作用向N2型的促癌作用转变。据报道,肿瘤细胞可以分泌趋化因子配体22 (CC-chemokine ligand 22,CCL22)、集落刺激因1 (colony-stimulating factor,CSF1)、血管内皮生长因子A (vascular endothelial growth factor A,VEGFA)等多种细胞因子,募集肿瘤相关巨噬细胞 (tumour associated macrophages,TAMs)。而募集至肿瘤组织的TAMs通过表达B7-H4或分泌程序性死亡配体1 (programmed cell death ligand 1,PDL1)[5-6],促进CD8+T细胞凋亡,从而使肿瘤细胞免受杀伤作用[7]。与巨噬细胞募集相似,肿瘤细胞还可分泌趋化因子配体15 (CXC-chemokine ligand 15,CXCL15)和高迁移族蛋白B1 (high mobility group protein B1,HMGB1)等,驯化肿瘤相关中性粒细胞 (tumor-associated neutrophils,TANs),从而抑制NK细胞和CD8+T细胞的肿瘤清除作用[8]。

免疫抑制细胞被招募至肿瘤微环境,形成免疫抑制微环境,促进肿瘤恶性进展,已成为研究热点。免疫抑制细胞主要包括MDSCs、Treg以及Th17细胞。研究表明,肿瘤细胞可通过分泌CXLC1、CXCL5、巨噬细胞转移抑制因子 (macrophage migration inhibitory factor,MIF)等促进MDSCs迁移至肿瘤组织[9]。MDSCs源于骨髓祖细胞和未成熟的髓细胞,是树突状细胞、巨噬细胞和粒细胞的前体,具有抑制免疫细胞应答的能力。目前尚无直接证据表明MDSCs能够促进肿瘤转移,但公认其免疫抑制功能参与肿瘤免疫逃逸。肿瘤微环境中募集而来的MDSCs一方面可以通过高表达一氧化氮合酶2 (nitric oxide synthase 2,NOS2)产生NO,抑制CD8+T细胞功能,另一方面也可通过精氨酸代谢,氧化T细胞表面识别受体 (T cell receptor,TCR),使得T细胞失活[10]。也有文献报道MDSCs可分泌IL-6、IL-23和TGFβ等因子募集Th17细胞,Th17细胞则通过分泌IL-17分子反作用于MDSCs,促进更多MDSCs招募,从而形成正向循环[9]。不仅如此,肿瘤相关成纤维细胞 (cancer associated fibroblasts,CAFs)也可分泌粒细胞集落刺激因子 (granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)促进MDSCs的募集[11]。在免疫逃逸中,Treg也发挥着非常重要的作用。一方面,肿瘤细胞可以通过多种细胞因子(如CCL5、CCL22等)募集到原位肿瘤,协助肿瘤细胞获得恶性表型;另一方面,Treg可促进CD8+T细胞凋亡,进而使肿瘤细胞获得免疫逃逸,同时Treg还可以通过诱导NK细胞凋亡促进肿瘤的发生发展[12]。此外,也有少量文献报道,调节性B细胞 (regulatory B cells,Breg)和浆细胞样树突状细胞可以通过调节Treg帮助肿瘤细胞进行免疫逃逸,但其相关机制尚不明确[13]。

预转移“壁龛”形成肿瘤细胞恶性增殖迫于瘤内生存压力及其所处微环境的调节,肿瘤细胞需要找寻新的“殖民地”以满足自身的生存需求。而在转移至新的“殖民地”即转移靶器官之前,肿瘤细胞已通过多种途径改造了靶器官的微环境,形成有利于其转移和生存的预转移“壁龛” (pre-metastatic niche)。改造途径为分泌细胞因子入血,经血液循环运送细胞至远端。研究表明,原位肿瘤细胞可将一系列细胞因子分泌入血,包括VEGFA、TGF-β、肿瘤坏死因子 (tumor necrosis factor,TNF)、赖氨酰氧化酶等,到达靶器官后,诱导趋化性蛋白S100A8、S100A9和血清淀粉样蛋白A3等表达,从而改变局部微环境。经改造的微环境可募集不成熟的髓源性细胞分泌基质金属蛋白酶9 (matrix metalloproteinase 9,MMP9)促进肿瘤细胞转移[14-15]。此外,髓源性细胞也可通过自身表面的整合素分子与预转移微环境中纤连蛋白结合,从而招募至预转移微环境[16]。TAMs及Treg也参与了预转移微环境的形成。肿瘤源性纤维蛋白凝块可促进TAMs募集至靶器官,增强肿瘤细胞恶性表型。同时,肿瘤细胞分泌的CCL2和CCL22等因子可促进Treg迁移至预转移微环境,形成免疫抑制微环境,有助于肿瘤细胞转移至靶器官后存活并生长[17-18]。不仅细胞因子可介导肿瘤细胞改造远端微环境,其代谢产物乳酸也可通过调节巨噬细胞的极化,影响预转移“壁龛”的形成[19]。近来有研究表明,原位的胰腺癌细胞可通过外泌体包裹MIF分子作用于Kupffer细胞,使其产生TGF-β,进一步影响远端肝组织中的肝星状细胞分泌纤连蛋白,形成有利于胰腺癌细胞肝转移的局部微环境[20]。可见,外泌体分泌也是肿瘤细胞调节远端预转移“壁龛”的一种重要的方式。

肿瘤细胞血管浸润性转移血管新生和侵犯血管是原位肿瘤细胞播散至远端的重要途径。研究表明,肿瘤组织中高表达的CSF1结合TAMs表面受体,激活下游的信号通路,一方面促进VEGFA和WNT7B等促血管生成分子的表达[21-22],另一方面抑制抗血管生成因子产生,最终促进血管新生。而新生血管的内皮细胞也可与TAMs相互作用,致使新生血管内皮细胞并非紧密连接,而是以疏松的连接方式相连,从而帮助肿瘤细胞穿透血管进入血循环[23]。

肿瘤细胞要突破血管基底膜离不开自身的高浸润转移能力,而这一能力的获得与TAMs、TANs等密切相关。在乳腺癌PyMT模型中发现TAMs伴随肿瘤细胞侵入周围血管。在侵入过程中,肿瘤细胞分泌CSF1,通过结合巨噬细胞表面受体CSFR1活化奥尔德里奇综合征蛋白 (Wiskott-Aldrich syndrome protein,WASP)促进巨噬细胞迁移,而迁移过来的巨噬细胞分泌表皮生长因子 (epidermal growth factor,EGF)反作用于肿瘤细胞,可进一步增强肿瘤细胞的迁移侵袭能力。除肿瘤细胞直接分泌因子募集TAMs外,CAFs也可通过分泌CXCL12募集TAMs,参与到肿瘤细胞与巨噬细胞的CSF1-EGF 正向循环[24]。甚至低氧微环境和CD4+T细胞来源的IL-4可诱导TAMs分泌组织蛋白酶B和C,重塑细胞外基质,以调节肿瘤细胞转移[25-26]。相反,在肿瘤细胞中敲除类固醇共刺激受体1(steroid receptor co-activator 1,SRC1)则可显著降低CSF1分泌,进而减少所募集的巨噬细胞数目[27]。因此,鉴于TAMs在肿瘤侵袭和转移中的重要作用,针对调控巨噬细胞亚型转变的关键信号通路设计的药物将有效抑制肿瘤转移。

在具有较高转移能力的人前列腺癌和纤维肉瘤的研究中发现,肿瘤细胞可以通过募集TANs到原位肿瘤,并通过其分泌的MMP9来促进肿瘤转移[28]。肝内胆管癌细胞来源的CXCL15可招募TANs,促进其肺转移。尽管有文献证实中性粒细胞可以促进肿瘤的转移,但是这一现象仍存在争议。在乳腺癌自发转移模型中,去除中性粒细胞后,肺癌转移增加;从肿瘤小鼠模型肿瘤组织中分离得到的中性粒细胞在体外能够通过产生H2O2杀死肿瘤细胞,过继回输这些中性粒细胞可明显抑制肿瘤肺转移[29]。

除TAMs和TANs外,MDSCs也参与肿瘤转移。在PyMT肿瘤模型和转基因黑色素瘤小鼠模型中发现,肿瘤细胞可分泌CXCL5募集MDSCs,后者通过分泌MMPs蛋白促进肿瘤转移[30]。而在4T1原位肿瘤模型中发现,肿瘤细胞还可通过MIF因子募集MDSCs[31]。由于MDSCs是一群未成熟的髓性细胞,后续很容易被诱导分化成为巨噬细胞或树突状细胞,因此尚缺乏有效的技术手段在体内研究MDSCs;并且在不同的临床肿瘤组织样本中,尚无统一的MDSCs表面标志分子,甚至同一种肿瘤中也存在多群具有不同表面标志分子的髓性细胞,发挥免疫抑制功能。所以在肿瘤转移过程中,尚未见针对MDSCs进行干预治疗的报道。

肿瘤远端转移灶形成肿瘤细胞脱离原位瘤到达远端形成转移灶,须在血液循环系统存活并能停留在转移靶器官。这一过程离不开预转移“壁龛”的提前准备、免疫逃逸以及TAMs和TANs等免疫细胞的帮助。血液循环系统中的肿瘤细胞可被Treg及TAMs分泌的特定因子激活AKT、NFκB等信号通路,以提供生存信号[32];也可结合纤维蛋白和血小板,形成一个保护层,逃避NK细胞的杀伤作用。同时,血小板还可为肿瘤细胞出血管转移至靶器官提供ATP[33]。另外,TANs可形成中性粒细胞胞外诱捕网 (neutrophil extracellular traps,NETs),促进循环肿瘤细胞存活和转移。NETs是由中性粒细胞释放到胞外,由DNA、抗菌蛋白、组织蛋白酶C及中性粒细胞弹性蛋白酶等组成的网状结构。NETs诱捕的肿瘤细胞可分泌CXCL8,促进中性粒细胞表达整合素αM,与肿瘤细胞表达的细胞间黏附分子1 (intercellular adhesion molecule 1,ICAM1)结合,促使肿瘤细胞黏附在转移靶器官[34-35]。

存活下来的循环肿瘤细胞可穿透血管到达预转移灶,并与肿瘤微环境成分进一步相互作用得以存活、生长。在PyMT模型中,发现自发转移的肺中存在两种不同类型的巨噬细胞,一种是与正常肺组织中定居的CD11c+巨噬细胞一样,另一种就是募集而来的MAMs。TAMs表达CD11b、VEGFR1和CCR2,而不表达GR1、血管生成素1受体 (angiopoietin 1 receptor,TIE2)和CD11c[36]。去除CD11b+巨噬细胞后,尾静脉注射乳腺癌细胞,肺转移明显减少,可见转移相关巨噬细胞的募集对于肿瘤的转移和转移灶生长非常重要。而血液循环系统中的单核细胞则是TAMs的一个重要来源。研究表明,肿瘤细胞能够通过分泌CCL2等细胞因子募集单核细胞迁移至微转移灶,并诱导成为TAMs,进一步分泌产生VEGFA促进肿瘤出血管生成和肿瘤细胞生长[37]。然而,出血管后的肿瘤细胞如何逃逸转移微环境中免疫抑制和杀伤作用,相关机制尚不明确。

靶向肿瘤转移相关免疫细胞的研究策略几乎在所有肿瘤中都能找到巨噬细胞的踪影。这些肿瘤相关巨噬细胞通过分泌细胞因子、趋化因子和基质蛋白酶等重塑微环境,促进肿瘤的生长、侵袭和转移[38]。相对于其他免疫细胞,TAMs参与肿瘤转移各个阶段的机制研究相对比较明确[39]。同时有研究证实TAMs会影响肿瘤治疗结果[40]。研究发现多烯紫杉醇可以杀灭具有免疫抑制功能的TAMs,同时诱导抗肿瘤髓性细胞的增加[41]。所以,针对TAMs设计干预药物治疗肿瘤已成为研究热点。

基于TAMs在肿瘤疾病过程中的重要作用和分子机制,已研发出一些相关药物。目前的策略是:(1) 清除TAMs; (2) 对TAMs进行再驯化,剥离促癌功能,保留正常功能[42]。基于完全清除的策略,与TAMs生存密切相关的CSF-1/CSF-1R必定成为研究热点。在美国的临床研究注册网站(https://clinicaltrials.gov)上已经可以找到多项关于CSF-1抑制剂与化疗联合的临床研究。在乳腺癌小鼠模型中,运用CSF-1R抑制剂和紫杉醇联合应用,可以显著抑制具有免疫抑制功能的TAMs,从而提高CD8+T细胞的杀伤作用,进而显著提高紫杉醇的治疗效果[43]。人CSF-1R特异性单克隆抗体 (RG7155)已经进入I期临床试验,用于治疗弥漫性巨细胞瘤[44-45],且已有患者从中获益。但是在抑制CSF-1R时,除了TAMs会被清除,非TAMs也会被清除,而且抑制了CSF-1R后有可能增加PD1和CTLA-4的表达。是否可以只清除TAMs呢？研究发现在绝大多数肿瘤中TAMs的募集必须依赖CCL2。通过抑制CCL2-CCLR2通路可以明显减少TAMs数量。通过抗体介导的CCL2抑制,可以明显抑制单核细胞募集到原位乳腺癌和肺转移的乳腺癌,导致肿瘤生长受抑,患者获益[46-47]。但是这样会导致肿瘤细胞代偿性分泌CCL2,同时抑制单核细胞募集,骨髓中滞留了大量单核细胞,一旦停药,肿瘤生长会迅速反弹[46]。清除TAMs的策略会产生许多不良反应,因此对肿瘤细胞进行再训化已然成为一种可选的策略。通过再训化增加巨噬细胞的抗肿瘤能力,同时降低其促肿瘤能力。研究发现,在小鼠乳腺癌模型中抑制IL10通路,可以显著提高化疗效果[48]。

巴维昔单抗 (Bavituximab)是一种具有临床应用前景的免疫药物,可靶向作用于磷脂酰丝氨酸。而在肿瘤患者化疗后,磷脂酰丝氨酸会暴露肿瘤新生血管内皮细胞,因此使用巴维昔单抗能有效阻断血管新生,延缓肿瘤转移。将巴维昔单抗与化疗药物联用,在非小细胞肺癌患者中进行Ⅱ期临床试验,发现两者联用的效果是单用化疗药物的 2 倍,且无进展生存期和总体生存趋势提高50%[49]。针对Ⅱ期或Ⅲ期直肠腺癌及HER2阴性的乳腺癌患者的临床试验也相继提上日程[50]。在动物实验中发现巴维昔单抗可以从多层面再激活已 “沉睡”的抗肿瘤免疫功能,包括促TAMs的M1型转化、抑制肿瘤相关MDSCs活化招募及参与树突状细胞向功能性抗原提呈细胞转化等,提示巴维昔单抗具有良好的临床应用前景[49,51-52]。

结语除了TAMs以外,机体内还有许多细胞参与肿瘤的进程,在有效认识各种细胞相关作用的前提下,针对某一特定细胞的功能进行药物设计是当下主流的干预思路。机体是一个整体,体内环境在不断变化,我们认为今后肿瘤免疫治疗的策略应该针对多种细胞参与的多个靶点进行干预以及调动机体免疫功能。

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The metastasis-promoting roles of tumor-infiltrating immune cells and potential therapeutic strategies

LUO Qin1,SHAO Wei-qing2,3,YANG Lu-yu2,3,YU Guang-yang1,QIN Lun-xiu1,2,3△

(1InstituteofBiomedicalSciences,FudanUniversity,Shanghai200032,China;2DepartmentofGeneralSurgery,HuashanHospital,Shanghai200040,China;3CancerMetastasisInstitute,FudanUniversity,Shanghai200040,China)

【Abstract】Tumor metastasis is mainly responsible for cancer mortality.It is promoted by both accumulation of intrinsic alterations and interaction of cancer cells with various stromal cells in tumor microenvironment.Tumor-infiltrating immune cells including tumor-associated macrophages (TAMs),myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) and regulatory T cells (Treg),have been shown to support immune suppression and the metastasis of tumor cells.The dissemination of tumor cells to distant organ sites necessitates a treacherous journey,which requires immune escape,pre-metastatic niche formation,tumor cell egress into blood circulation finally arrival at the target organ and persistent metastatic growth.Each step of tumor metastasis is fostered by the communication between tumor and immune cells.This review focuses on the interactions between tumor cells and tumor-infiltrating immune cells,and potential immune strategies.

【Key words】tumor metastasis;immune cells;targeting pro-metastatic immune cells

【中图分类号】R 392.12; R 730

【文献标识码】B

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.01.019

(收稿日期:2015-11-06;编辑:段佳)

△Corresponding authorE-mail:qinlx@fudan.edu.cn