肿瘤的进化与异质性及其在转移中的意义

魏金旺　盛媛媛(综述)　钦伦秀△(审校)

(1复旦大学生物医学研究院　上海　200032; 2复旦大学附属华山医院普外科　上海　200040; 3复旦大学肿瘤转移研究所　上海　200040)



肿瘤的进化与异质性及其在转移中的意义

魏金旺1,2,3盛媛媛1,2,3(综述)钦伦秀1,2,3△(审校)

(1复旦大学生物医学研究院上海200032;2复旦大学附属华山医院普外科上海200040;3复旦大学肿瘤转移研究所上海200040)

【摘要】肿瘤转移是恶性肿瘤最主要的生物学特性之一,也是导致患者死亡的主要原因。肿瘤的转移潜能是肿瘤异质性的表现之一,而异质性则起源于肿瘤细胞本身及宿主微环境在进化上的差异。这些进化上的差异除了传统理论所认为的基因突变之外,还包括表观基因组学调控、蛋白质修饰等非基因水平方面的改变。本文将结合“种子与土壤”理论,从肿瘤进化与异质性的角度,综述肿瘤细胞自身和癌周环境对肿瘤转移的影响,以期推动肿瘤转移的研究及拓展诊疗思路。

【关键词】肿瘤转移;进化;异质性

恶性肿瘤是威胁人类健康最严重的疾病之一[1],而具有局部浸润和远处转移的能力是恶性肿瘤最主要的生物学特性之一,也是导致患者死亡的主要原因[2]。

肿瘤侵袭转移过程是肿瘤细胞与宿主微环境之间相互作用的动态连续过程,这个过程是复杂的、多步骤的,对其机制的研究也经历了漫长的过程[3]。Paget提出的“种子与土壤”经典转移理论已经在基础和临床研究中得到充分验证[4-5]。基于这一理论,本文将从“种子”和“土壤”两个方面,重点介绍进化和异质性与肿瘤转移的关系,对恶性肿瘤转移的相关机制进行综述,以期推动恶性肿瘤转移的研究及拓展诊疗思路。

肿瘤进化和异质性的起源:两种假说

在从正常细胞发展到肿瘤细胞的过程中,进化和异质性是一直互相伴随的。在正常细胞中就存在异质性,表现为各个体之间遗传背景的差异,以及同一个体不同器官之间的分化状态差异[6-7]。在发生一系列的致瘤事件之后,所形成的肿瘤之间具有肿瘤间异质性。随着肿瘤的进展,进一步形成了肿瘤内异质性,即同一肿瘤内存在基因与表型不同的亚克隆,原发瘤与转移灶之间、转移灶与转移灶之间也可能存在差异[8]。除了上述的空间异质性之外,肿瘤在发生之初与进展之后也存在时间异质性[6]。由此可知,侵袭能力的出现是肿瘤进化过程中产生的异质性之一。关于肿瘤异质性的来源,目前存在两种假说模型,即克隆进化模型和肿瘤干细胞模型[8-9]。

克隆进化模型(clonal evolution model)克隆进化模型认为起源于单个细胞的肿瘤细胞群在增殖能力和表型上存在异质性,正常细胞在恶性转化时涉及始发突变、潜伏、促癌和演进等多个步骤,而多次突变造成的基因型多样性和表型多样性是肿瘤异质性存在的基础[10]。2012年在一项具有里程碑意义的肾细胞癌研究中,Gerlinger等[11]发现,同一原发瘤的不同取材位点、原发瘤与转移灶、治疗前与治疗后的基因型是不一致的。这一实验表明在肿瘤组织的各个区域中存在不同的促癌变异,有力地支持了克隆进化模型假说。

肿瘤干细胞模型(cancer stem cell model)即肿瘤组织中的一小部分肿瘤干细胞是异质性的基础,它们可以不断增殖,自我更新,并具有多向分化潜能,在启动肿瘤形成和生长中起到决定性作用,而其余大多数细胞经过短暂分化,最终死亡[12]。Kreso等[13]发现同一病例的后代肿瘤细胞在多次种植后依然具有相同的基因组变异,但可以观察到5种在增殖能力和化疗敏感性上显著不一致的表型。这一实验证明了并不是所有的表型变化都是由基因的变化产生的,这与肿瘤干细胞模型的观点是一致的。

当然,这两个假说不是独立的,是一个共存、动态的过程,肿瘤异质性的基因结构与形态表现取决于遗传与环境的相互作用。

“种子”的进化与异质性

近年来大量对肿瘤的深度测序研究试图回答关于转移的3个问题:转移的关键突变基因有哪些;转移发生在肿瘤进化过程的早期还是晚期;转移是单克隆还是多克隆定植。

转移的关键突变基因肿瘤进化学说中基因突变是肿瘤进化过程所必需的,尽管随着测序技术的发展,大量肿瘤基因突变信息的获得已不再困难,但肿瘤发生发展过程中基因突变的顺序、哪些是关键基因突变等等依然还未得到明确解答。

为了寻找肿瘤转移相关的关键突变基因,研究人员通过将肿瘤的转移灶与原发灶的突变信息进行对比分析。Nadauld等[14]就在弥漫性胃癌的卵巢转移灶与原发灶的比对中发现了TGFBR2的突变在转移发生中的重要作用,并通过体外类器官模型中的功能实验验证了该基因对转移的关键作用。

而近几年在胰腺癌、急慢性淋巴细胞瘤、黑色素瘤及乳腺癌等多种类型肿瘤中都建立了肿瘤进化树,从中得到肿瘤进化过程中关键性的主干及分支突变。其中分支突变代表同一肿瘤中的不同亚克隆,包括转移的亚克隆[15]。随着这些关键基因突变的进化关系逐渐被探知,为临床靶向药物的靶点选择提供了更扎实的理论基础。

转移在肿瘤进化中发生的时间转移在肿瘤发展过程中发生的早晚是了解患者疾病进展的关键,也是临床治疗关注的焦点。在肿瘤基因水平上对转移的研究,是在建立肿瘤进化树的基础上,从亚克隆之间的关系探讨转移发生在肿瘤进化的早期亦或晚期。

许多研究支持肿瘤转移发生在进化早期。Hüsemann等[16]利用自发性乳腺癌小鼠模型发现,在乳腺上皮畸变的同时已能在骨髓中发现恶性转移的细胞,这些细胞具有大量的细胞间异质性。这项研究表明乳腺癌细胞的系统性扩散可能在细胞恶性转化开始后不久即已发生。随后Campbell等[17]在对胰腺癌转移的一项研究中发现,转移克隆与原发克隆可以处在同一甚至更早的进化等级。Wu等[18]针对髓母细胞瘤转移的研究也同样支持这一理论。

但同样有很多研究支持肿瘤转移可能发生在进化晚期。Yachida等[19]发现同一患者各转移瘤的大多数基因突变都已存在于原发瘤中,而且不同部位的转移灶都能在原发瘤中找到对应的肿瘤细胞亚克隆。此结果支持胰腺癌的早期诊断可能会带来较长的有效治疗时间窗口的理论。同时期在前列腺癌和乳腺癌中的测序研究也得到了相似结果[20-21]。

值得一提的是Navin等[22]利用单细胞测序技术对乳腺癌的研究结果也支持转移在进化上的晚期发生。该研究发现原发灶与转移灶的单细胞测序拷贝数变异 (CNV)数据高度相似,支持转移发生在克隆进化晚期这一理论。

转移的克隆定植多样性Mcfadden等[23]在一项对肺癌的研究中,通过回溯肿瘤细胞转移的路径,发现尽管来自肺肿瘤的多种细胞亚群可迁移到淋巴结,但通常只有来自淋巴结的一种细胞亚群扩散至肝脏。这一研究发现了肿瘤细胞的单克隆定植现象,也表明肿瘤内不同克隆亚群的单克隆转移定植可能使得转移治疗复杂化。

随后的多项研究使肿瘤细胞转移的克隆定植多样性呈现得更加清晰,也使得转移的治疗面临更复杂的局面。Maddipati等[24]在胰腺癌转基因小鼠转移模型中发现从原发灶到多个转移灶的多克隆定植的现象。而Gundem等[25]通过对10例肾癌患者的原发瘤及多发转移灶的测序分析,在临床患者身上直接找到了原发灶到转移灶、转移灶到转移灶的不同途径多克隆转移的证据,支持了多克隆定植转移的理论。

除基因组水平外,肿瘤细胞转移潜能的异质性在表观遗传、转录组、蛋白质组等水平上的表现更为复杂。Vanharanta等[26]的一项关于透明细胞肾癌的研究发现,肿瘤抑制因子的突变与患者预后并无显著相关性,但其表观遗传学的改变激活了CHL-HIF通路,促进了肿瘤的转移,且与患者预后显著相关。而Liu等[27]也在胃癌中发现启动子区及第一外显子区域低甲基化特征与胃癌转移密切相关。

“土壤”的进化与异质性

癌周微环境、转移靶器官微环境乃至宿主整体的遗传背景也具有复杂的异质性,对肿瘤转移潜能的发挥产生很大的影响。

癌周微环境癌周微环境包含了三大类细胞,即肿瘤相关成纤维细胞、免疫细胞、血管内皮细胞[28]。肿瘤组织具有动态的物理形态,由于各种生长因子、血管供应和免疫细胞的相互作用,即使在肿瘤内部的同一部位,其结构和组分都可能差异巨大[29]。免疫浸润包括多种类型的细胞,且存在不同的活化状态和在肿瘤内的定位[30]。血管网络在组织来源、成熟度、间隙压力等方面各不相同。肿瘤相关成纤维细胞也在活化状态、组织内定位、应激反应和来源上有很显著的差异。加上细胞外环境如含氧量、基质成分等的差异,造成了肿瘤微环境复杂的异质性。肿瘤微环境与基因共同决定细胞表型,对肿瘤的转移具有调控作用[31-32]。例如,Paolino等[33]研究了黑色素瘤中NK细胞与肿瘤转移的关系,在转基因小鼠中NK细胞本身具有抑制肺转移的功能,但Cbl-b或其配体E3的表达可影响其抑制肿瘤转移的能力。

转移位点的微环境除了原发瘤所处的微环境,转移位点的微环境也能影响肿瘤的转移,各个器官微环境的异质性造成了肿瘤细胞的器官选择性[3]。例如,乳腺癌倾向于转移至肺、脑、肝和骨髓[34-37],而肠癌倾向于转移至肝和肺[38]。肿瘤的靶向转移,取决于肿瘤细胞自身的异质性与靶器官微环境异质性的相互作用。例如,乳腺癌转移至4个不同的器官,原发瘤自身所激活的信号通路各不相同[34-37],即使同为骨转移,乳腺癌和前列腺癌激活的信号通路也不一样[34,39]。

关于“种子”对靶器官的选择,Psaila等[40]提出了“转移前壁龛 (premetastatic niche)”理论,认为原发瘤会释放一系列信号分子,使转移灶周围的成纤维细胞活化,并募集骨髓中的造血祖细胞,以及循环中的免疫抑制细胞,从而改造局部微环境,且所有这些变化都是在肿瘤细胞到达转移位点前就完成的[41]。肿瘤细胞自身分泌的细胞因子,以及靶器官微环境,都会影响转移前壁龛的形成。

在转移的器官选择方面,对微环境各个组分的研究也已经很多。例如,Zhang等[42]研究了高表达Src的细胞对骨转移的高选择性。该研究从肿瘤相关成纤维细胞的分泌谱中筛选了CXCL12和IGF1两个因子,用这两个因子预处理的乳腺癌细胞表现出高度骨转移,证明了癌周微环境可以诱导肿瘤细胞的靶向转移。

遗传背景的异质性另一个与转移相关的方面是遗传背景的异质性[43-44]。遗传背景指的是全基因组范围内的一些序列变异,这些可以稳定遗传的变异也构成了对疾病易感性的差异。常见的遗传背景改变包括单核苷酸多态性(SNP)和CNV,他们存在于个体的所有细胞当中,所以可以同时作用于“种子”和“土壤”,在肿瘤发生、发展和转移的每一步中都发挥作用。遗传背景的改变常常发生在非基因编码区,功能可能非常微小,一个个体中的无数改变共同决定其转移潜能[45]。

Lifsted等[46]用一个经典的动物实验模型证实了遗传背景对转移的影响。他将雄性PyMT小鼠与不同遗传背景的自交系小鼠杂交,发现F1子代转移潜能不同。在这一实验中,致瘤事件一致,所以转移潜能的差异来自于亲代的遗传背景异质性。在这一动物模型的基础上,科学家们鉴定出了Sipa这一转移相关基因,并发现该基因上携带的SNP位点能够影响患者的预后[47-48]。

对遗传背景研究的最经典工具是全基因组关联研究 (GWAS),这一技术在2005年首次用于人类疾病的研究,通常一张GWAS芯片能够一次性检测50～100万个SNP位点。Mirabello等[49]在转移组和非转移组骨肉瘤之间寻找到2个差异较为显著的SNP位点,可能是潜在的转移易感位点,并发现其中一个位点与患者的预后关系十分显著。该位点所在的基因被证明能够影响肿瘤细胞的运动能力。

结语

在临床上,肿瘤内异质性给患者的诊断和分型,以及据此产生的靶向治疗方案带来了挑战。近来对CTC和ctDNA的研究发展也许能够解决这一问题[50～51],同时影像学的发展也是解决这个问题的途径之一[52～53]。

肿瘤转移的基因水平研究无疑为肿瘤靶向药物治疗提供了坚实的理论基础。靶向治疗的耐药问题一直困扰着肿瘤临床治疗,从肿瘤异质性的角度来说,耐药机制主要有两种理论模型[54]。从肿瘤进化理论的角度,是对已存在的优势克隆的环境选择,该观点着眼于基因水平的突变。而从肿瘤干细胞理论来看,则是静息肿瘤干细胞的激活,该论点侧重于表观以及信号通路等非基因水平。

肿瘤“种子”和“土壤”的双重异质性给人类战胜肿瘤带来了挑战,相信随着研究的深入,这些性质将使人类增加了解它的途径并找到战胜它的靶点。

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Cancer metastasis:From the perspective of evolution and heterogeneity

WEI Jin-wang1,2,3, SHENG Yuan-yuan1,2,3,QIN Lun-xiu1,2,3△

(1InstituteofBiomedicalSciences,FudanUniversity,Shanghai200032,China;2DepartmentofGeneralSurgery,HuashanHospital,FudanUniversity,Shanghai200040,China;3CancerMetastasisInstitute,FudanUniversity,Shanghai200040,China)

【Abstract】Metastasis is one of the biological hallmarks of malignancy and the principal cause of death of patients.Recent years,metastatic potential is thought at least to be due to tumor heterogeneities which origin from the differences generated in the evolution process of cancer itself as well as host microenvironment.Derived from traditional theories,tumor heterogeneity includes more than gene mutations.The changes of non-genetic levels like epigenetic regulation and post-translational modification are widely considered.Based on the “seed and soil” theory about metastasis,this review summarizes the advances of studies in cancer metastasis from the perspective of evolution and heterogeneity,hoping to promote the study of metastasis and clinical control application.

【Key words】metastasis;evolution;heterogeneity

【中图分类号】R73-37

【文献标识码】A

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.01.022

(收稿日期:2015-11-10;编辑:沈玲)

△Corresponding authorE-mail:qinlx@fudan.edu.cn