杂种白杨717-1B4组培技术研究

郑瑞丰 赵博文 叶 融 张文彪 王华芳

(1. 北京林业大学林木育种国家工程实验室, 生物科学与技术学院，北京 100083；2. 北京市延庆区第一职业学校，北京 102100)



杂种白杨717-1B4组培技术研究

郑瑞丰1赵博文1叶 融1张文彪2王华芳1

(1. 北京林业大学林木育种国家工程实验室, 生物科学与技术学院，北京 100083；2. 北京市延庆区第一职业学校，北京 102100)

为保持杂种白杨717-1B4的优良性状，解决生根困难瓶颈，建立了生理年龄一致性和容器化生根炼苗的组织培养繁育技术。结果表明：外植体为母株根蘖的根际萌芽，以有效氯1.0%的乙氰脲酸钠溶液灭菌25 min，接种在MS培养基上效果最好，再生不定芽达75.91%；以再生不定芽3个以上的外植体进行继代培养，继代周期为30 d，平均再生不定芽12.2个；外植体再生的不定芽扩繁1次转移至营养钵基质上生根和练苗，增殖系数达3.73，增殖培养基为MS + 6-BA 0.5 mg/L+ NAA 0.2 mg/L；生根培养基中IBA为2.0 mg/L生根最好，生根率达98.89%；揭开培养瓶盖驯化小植株容器苗，使之适应自然环境，驯化成活率达92.5%。

杂种；白杨717-1B4；组织培养；不定芽；生根；炼苗

杂种白杨717-1B4(Populustremula×Populusalba) (以下简称717-1B4杨) 属白杨派落叶乔木[1]，整合了欧洲山杨 (Populustremula) 速生、干形通直、材质优良、树形美观等速生优质特性，以及银白杨耐干旱、贫瘠、寒冷和轻度碱土等抗逆优势，成为欧美杨育种最成功的典范。717-1B4杨被广泛用于研究杨树杂交育种机制和抗旱、耐盐、净化重金属污染等抗逆机制；用于城乡行道树和群体绿化，防风固沙、保持水土、护岸固坡以及荒山荒地生态建设和商品林生产。

我国学者曾多次进行717-1B4杨引种，由于其白杨派树种难生根的特性[2]，插穗繁殖难以成活[3]。组织培养成为多数植物快速繁殖的有效手段[4]。杂种银中杨[5]、山新杨[6]、三倍体毛白杨[7]、三倍体山杨[8]、银河 Ⅰ 号[9]、箭胡毛杨[10]、84 K杨[11]等已进行了相关研究，杂种白杨叶柄[12]、嫩叶[13]、新稍[14]、茎段[15]等已作为外植体探索组织培养繁殖体系。外植体取材部位的生理年龄、愈伤组织诱导及植株再生、组织培养不定芽继代培养的生理年龄积累等都能导致植株变异[16]和无性系退化。但是选择和采集母株生理年龄最年轻的根茎起源部位的萌芽作为外植体再生植株，其生理年龄与母株基本保持一致，从而保持其性状的基本稳定[17]。本研究从美国引进717-1B4杨繁殖材料，以根蘖植株的根际萌芽建立生理年龄一致性容器化生根炼苗组织培养育苗技术，提出并探讨遏制组织培养无性系退化的原理和方法，建立717-1B4杨保持母株性状和安全驯化成活的组织培养育苗技术体系，对其他树种的同类问题解决有一定参考价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2010年从美国引进717-1B4杨繁殖材料，在温室条件下从根孽获得植株，春季种植于北京延庆试验基地 (东经110.97°，北纬40.47°)，作为选择和采集外植体的母株。

1.2 试验方法

1.2.1 无菌培养试验

春季选择田间生长的健康无病虫害的717-1B4杨植株，采集根际萌芽作为外植体，以软毛刷清洁表面，蘸少许对氯间二甲苯酚溶液 (商品名为滴露，Dettol) 表面清洗，剪取长1.5～2.0 cm具1～2个休眠芽的茎段，用自来水冲洗20 min；在无菌条件下以70%乙醇表面处理30 s，置入消毒剂中表面灭菌。消毒剂浓度分别为0.5%、1.0%、1.5%的乙氰脲酸钠 (NaDCC) 溶液 (水100 mL，NaDCC 0.65 g片剂2、4、6片，吐温-80 0.4 mL)，灭菌时间为20、25、30 min，共9个处理 (表1)，无菌水冲洗5次，每次3 min，在灭菌滤纸上沥干水分，接种于MS培养基上；每处理30个外植体，在组织培养条件下 (光照强度36 μmol/(m2·s)，光/暗节律16 h/8 h，温度 (25 ± 1) ℃，下同) 培养15 d，统计外植体去污染率、存活率，筛选外植体表面灭菌最适合的消毒剂浓度和灭菌时间。

表1 不同处理有效氯浓度及消毒时间

1.2.2 生理年龄一致性不定芽再生试验

将去污染的无菌外植体分别转移到1/2MS (B1)、MS (B2)、WPM (B3) 培养基上，每处理22个外植体，3个重复。在组织培养条件下培养30 d，统计每外植体再生不定芽数量，筛选外植体最适培养基。

选择外植体再生不定芽3个以上的接种在上述筛选培养基上，在相同条件下继代培养，每30 d继代1次，采集并统计每外植体再生的不定芽数量，测量其长度并观察生长状况。

1.2.3 不定芽扩繁试验

外植体再生的不定芽修剪成1.5～2.0 cm长，接种在增殖培养基上扩繁1次以迅速扩增其数量。增殖培养基为MS培养基，分别添加植物生长调节剂6-BA 0.5、1.0、1.5 mg/L和NAA 0.1、0.2、0.3 mg/L，组合成9个处理 (表2)，每处理接种外植体30个。在组织培养条件下培养30 d，统计分析不定芽扩繁数量、长度及其生长状况，筛选最适扩繁培养基。

表2 不同处理2种生长调节剂的浓度 (mg·L-1)

1.2.4 容器化生根和炼苗试验

不定芽在营养钵基质中生根和炼苗[18]，以避免717-1B4杨小植株移栽损伤根系难以缓苗恢复致死。1) 容器化生根，上述扩繁1次的不定芽生长至4～5 cm高时转移至聚乙烯营养钵基质中诱导生根形成容器苗。生根基质为草炭土与珍珠岩的混合物 (1∶1,v/v)，虹吸生根培养基溶液至饱和，置入组织培养瓶中灭菌 (121 ℃, 0.11 MPa, 15 min) 备用。生根培养基为1/2MS+IBA，IBA浓度分别为1.0 (D1)、1.5 (D2)、2.0 (D3)、2.5 (D4) mg/L。不定芽在操作工作台上接种，每处理30株；在组织培养条件下培养30 d形成生根的小植株容器苗；统计生根率，筛选最适生根培养基。2) 容器化炼苗，载有小植株容器苗的培养瓶转移至过渡室，逐渐打开培养瓶盖，1/4、2/4、3/4和4/4，持续时间依据小植株叶片萎蔫情况逐渐延长，直至小植株叶片不萎蔫，容器苗从培养瓶中取出正常田间养护管理，统计植株驯化成活率。

1.2.5 数据处理

试验数据以Excel 2007处理图表，并进行SPSS方差分析、多重比较 (Duncan法) 及相关性分析，百分数经反正弦 (y=arcsinx) 转换处理。

2 结果与分析

2.1 不同处理外植体表面灭菌的效果

717-1B4杨根际萌芽外植体表面灭菌效果见表3。处理A1去污染率最低，但去污染外植体全部成活；处理A9去污染率最高，但去污染外植体60%死亡。相关性分析 (表4) 表明，消毒剂浓度与外植体去污染数呈极显著正相关，消毒时间无显著相关。但随着消毒剂浓度升高和消毒时间延长，外植体死亡数随之增加及成活率降低。综合考虑外植体表面灭菌去污染率及成活率，处理A5最优，即效氯浓度1.0%的乙氰脲酸钠溶液灭菌25 min，外植体去污染率及成活率都较高。

表3 不同处理717-1B4杨根际萌芽外植体表面灭菌的效果

表4 消毒剂浓度、消毒时间与外植体去污染数、成活数相关性

2.2 外植体再生不定芽的培养基

由表5可知，外植体在MS培养基上再生不定芽的数量高达75.91%，在1/2MS、WPM上分别为16.81%和10.45%，差异极显著。因此，以外植体在MS培养基上再生不定芽进行后面的试验。

表5 3种培养基对717-1B4杨外植体再生不定芽的影响

2.3 外植体继代次数对再生不定芽品质的影响

717-1B4杨外植体再生不定芽较多者 (3个以上) 在相同条件下继代培养6次，再生的不定芽除个别叶片出现边缘卷曲、变黄 (表6)，生长状况随继代次数增加无明显差异。每外植体继代1～6次的再生不定芽数量平均为 (12.2 ± 0.95)个，其变化范围为11.0～13.5个；不定芽高生长、叶片大小等变化均不显著。

表6 717-1B4杨外植体继代次数对再生不定芽生长的影响

2.4 植物生长调节剂对不定芽增殖的影响

植物生长调节剂细胞分裂素 (6-BA) 和生长素 (NAA) 的浓度和比例对717-1B4杨不定芽增殖的效果见表7。增殖系数为1.23～3.73，其中处理C2不定芽增殖系数最大，达3.73。相关性分析 (表8) 表明，6-BA浓度与不定芽增殖系数呈极显著负相关，随着6-BA浓度增大不定芽增殖系数降低。NAA浓度与不定芽增殖无显著相关性，但NAA浓度为0.2 mg/L的增殖系数大于0.1 mg/L和0.3 mg/L。综合分析结果表明， 6-BA 0.5 mg/L、NAA 0.2 mg/L组合处理的不定芽增殖效果最好。

表7 植物生长调节剂对717-1B4杨不定芽增殖的影响

表8 植物生长调节剂浓度与717-1B4杨不定芽增殖系数的相关性

2.5 IBA浓度对717-1B4杨不定芽容器化生根的影响

717-1B4杨不定芽容器化生根形成小植株容器苗，不定芽在添加5种浓度的IBA生根培养基上，生根率均比对照提高40%以上 (表9)。IBA浓度与生根率的相关性显著 (表10)，1.0～2.0 mg/L的IBA不定芽生根率随其浓度升高而提高；IBA 浓度为2.0 mg/L (D3) 时，生根率最高，达98.89%。因此，IBA促进717-1B4杨不定芽生根的最适浓度在2.0～2.5 mg/L (D4) 范围内。

表9 不同IBA浓度处理717-1B4杨不定芽容器化生根的影响

表10 IBA浓度与717-1B4杨不定芽容器化生根率的相关性

717-1B4杨小植株容器化炼苗，简化了移栽和缓苗程序。在过渡室内逐渐打开组织培养瓶盖至使容器苗小植株叶片不萎蔫时，从培养瓶中取出炼苗使之形成适应自然环境的组织培养容器苗，146株容器苗经过容器化炼苗驯化成活135株，驯化成活率达92.5%。

3 结论与讨论

本研究基于植物具有不同生理年龄的细胞和组织，选择717-1B4杨根蘖植株的根际萌芽作为外植体，以保持外植体生理年龄与母株一致；以外植体再生不定芽保持了繁殖后代生理年龄与外植体亦即与母株一致，从而保持了组织培养无性系与母株性状的一致性；基于白杨派树种难生根特性，容器化生根和炼苗避免了717-1B4杨组织培养小植株移栽驯化阶段因须根受到损伤难以缓苗恢复而死亡，基本实现安全渡过炼苗阶段驯化成活。本研究涉及717-1B4杨无性繁殖的2个关键问题。

1) 保持母株优良性状，遏制无性系退化。植物无性繁殖的优势在于保持母株遗传性状。在实际操作中由于母株各部位生理年龄的差异性，从母株上采集的繁殖材料种类、部位、繁殖方式或途径等均可能导致无性系退化。毛白杨扦插繁殖为遏制其无性系退化创建了多圃系育苗技术[25]，其根繁圃、采穗圃、繁殖圃等基于植物组织培养的理论和过程。而植物组织培养仍然存在无性系退化，在母株和外植体选择、无菌培养体系建立、不定芽扩繁、不定根发生、小植株移栽驯化5个阶段中母株和外植体生理年龄差异同样会导致无性系变异；外植体诱导愈伤组织再生植株对环境敏感容易发生变异[19]；不定芽继代培养的生理年龄积累同样会发生退化变异[20]，组织培养不定芽途径较稳定地保持母株的遗传性状[21]，其繁殖后代最大程度地与母株保持一致。毛白杨×响叶杨茎段为外植体诱导再生的不定芽系数为6.38[22]。本研究每外植体平均再生不定芽12.2个，且根际萌芽再生植株的生理年龄与外植体和母株一致；外植体分化的不定芽扩繁1次的生理年龄相对于多次继代扩繁的积累，其数量因此迅速扩大。

2) 提高难生根树种717-1B4杨小植株移栽炼苗的成活率。白杨派树种难生根的特性限制其无性快速繁殖，组织培养依据植物细胞全能性在试管内诱导生根是解决其繁殖困难的有效途径。但不定芽通常在以琼脂为半凝固物的培养基上生根[23]，移栽驯化阶段小植株根系从琼脂转移至栽培基质的过程中虽然以温水融解琼脂，在整个过程中根系必然造成损伤，不得不缓苗恢复重建。在这种情况下难生根树种虽然不定芽生根率高，根系难以通过缓苗恢复其结构和功能，致使移栽成活率很低[24]，本研究以容器化生根和炼苗方式避免717-1B4杨组织培养植株因移栽大量死亡。以营养钵置入培养瓶，以栽培基质替代琼脂，以基质虹吸替代琼脂和生根培养基 (1/2MS + IBA 2.0 mg/L) 加热溶解，不定芽生根率达98.89%，为容器化炼苗提供了必要基础；小植株驯化过程的移栽、缓苗、炼苗等程序转变为揭开培养瓶盖使容器苗适应自然环境，整个过程不损伤而是完整保护根系；92%以上小植株安全渡过炼苗阶段，驯化成为适应自然环境的容器苗。

本研究以根际萌芽再生不定芽保持母株生理年龄一致和以容器化生根-炼苗保持难生根树种717-1B4杨组织培养小植株安全炼苗及驯化成活的思路和方法，也为解决林业的同类问题提供启示。

致谢：本项研究材料由美国康涅狄格大学李义教授提供，试验过程中北京八达岭林场赵广亮先生给予了帮助，在此一并致谢!

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(责任编辑 韩明跃)

Micropropagation Techniques of Hybrid Aspen Clone 717-1B4

Zheng Ruifeng1, Zhao Bowen1, Ye Rong1, Zhang Wenbiao2, Wang Huafang1

(1. National Engineering Laboratory for Tree Breeding, College of Biological Sciences and Biotechnology,Beijing Forestry University, Beijing 100083, China;2. First Vocational School of Yanqing District, Beijing 102100, China)

In order to maintain the maternal excellent features in offspring and refrain from difficult rooting in vegetative propagation of hybrid aspen, established a juvenility and container rooting-hardening micropropagation system in the present work. The result showed that explants taken from the sprouting between root-shoot junctions of maternal plants, sterilized by soaked 1.0% effective chlorine of sodium dichloroisocyanurate (NaDCC) solution for 25 min, cultured on MS medium, 75.91% of them regenerated juvenile shoots. The explants regenerated more than 3 juvenile shoots were selected and sub-cultured on the same fresh medium in each 30 days, each explant produced 12.2 shoots on average. The shoots from explants multiplicated one time before did container rooting and hardening. The shoots increased 3.73 times on MS medium containing 6-BA 0.5 mg/L and NAA 0.2 mg/L, respectively. The rooting rate reached the highest at 98.89% when IBA was 2.0 mg/L in rooting medium. The container plantlets hardened in reversion and acclimatization by shifting and opening gradually the tissue culture bottles. The container rooted aspen plants survived at 92.5% in the acclimatization stage.

hybrid, aspen 717-1B4, micropropagation, adventitious bud, rooting, plantlets hardening

10. 11929/j. issn. 2095-1914. 2016. 06. 007

2016-06-08

国家自然科学基金 (3370598)；国家自然科学基金 (J1103516)。

王华芳 (1956—)，男，教授，博士生导师。主要研究领域为植物生物技术 (生物工程)。Email: hfwang.163@163.com。

S718.46

A

2095-1914(2016)06-0041-06

第1作者：郑瑞丰 (1989—)，男，硕士生。研究方向：植物生物技术。Email: zhengruigeng@126.com。