霍山石斛拟原球茎生长及植株再生过程中微观结构与元素的变化

杨 静 何 芳 王 纪 方炎明 戴 斌

(1. 南京林业大学南方现代林业创新中心，生物与环境学院，江苏 南京 210037；2. 南京林业大学现代分析测试中心，江苏 南京 210037；3. 焦作大学化工与环境工程学院，河南 焦作 454000；4. 南京晓庄学院，江苏 南京 210017；5. 皖西学院生物与制药工程学院， 安徽 六安 237012)



霍山石斛拟原球茎生长及植株再生过程中微观结构与元素的变化

杨 静1,2何 芳3王 纪4方炎明1戴 斌5

(1. 南京林业大学南方现代林业创新中心，生物与环境学院，江苏 南京 210037；2. 南京林业大学现代分析测试中心，江苏 南京 210037；3. 焦作大学化工与环境工程学院，河南 焦作 454000；4. 南京晓庄学院，江苏 南京 210017；5. 皖西学院生物与制药工程学院， 安徽 六安 237012)

采用SEM/EDS技术，研究霍山石斛拟原球茎生长及植株再生过程中结构和元素的变化，分析其发育过程及药效成分。结果表明：适当的组培条件会使外植体表层具有分生能力的细胞不断分裂和增殖形成拟原球茎和次拟原球茎。其中拟原球茎分化出芽和根，完成幼苗的形态发育。30 d后幼苗的根无明显的根毛和根被组织；茎表皮多纵向皱褶，横切面边缘具波状棱角，细胞内含物黏液状，外韧有限维管束散生；等面叶，四列型气孔只分布于下表皮，保卫细胞肾形。拟原球茎形成期，含有较多的Na、S、K、Al、Si、Fe，分化期P、Cl、Mn、Ca增多，幼苗所含K、Ca增幅较大，其他元素减少或变化不明显。

霍山石斛；拟原球茎；植株再生；微观结构；元素

霍山石斛 (Dendrobiumhuoshanense) 是兰科石斛属多年生附生草本植物，具有极高的药用及观赏价值[1-2]，但因其对生长环境要求苛刻，加之繁殖困难、人为过度采挖，资源已濒临灭绝[2-5]。因此，研究霍山石斛资源的可持续开发和利用迫在眉睫。

国内外关于霍山石斛的报道主要集中在快繁、移栽驯化以及药理药效等方面[6-18]。拟原球茎再生植株途径是霍山石斛重要的快繁方式，具有遗传性状稳定、高效的优点。拟原球茎 (PLBs) 由Morel于1960年在兰属植物的茎尖培养中发现，其类似于原球茎的生长与结构特征。蝴蝶兰的拟原球茎发育研究，证实了拟原球茎形成过程即为体胚发生过程[19]。詹忠根等[20]综述了兰科植物拟原球茎的形态建成，张启香等[21]、金青等[22]也分别报道过铁皮石斛和霍山石斛拟原球茎诱导及发育并进行了光学显微观察，均未涉及元素成分的变化。本试验拟采用扫描电镜 (SEM) 进一步观察霍山石斛拟原球茎生长及植株再生的动态过程，并结合X射线能谱仪 (EDS) 技术，对机体所含元素成分进行分析，一方面为霍山石斛的快速繁殖和工厂化生产提供形态学依据，另一方面也了解其所含元素成分与形态建成过程以及药用价值的关系。

1 材料与方法

1.1 材料来源与培养条件

霍山石斛试管苗取自皖西学院生物与制药工程系石斛组培室，在南京林业大学植物组培室进行培养。以 MS和1/2MS为基本培养基，120 ℃高压灭菌20 min，冷却凝固后备用。培养条件为：温度 (25 ± 1) ℃，光照强度1 600～2 500 lx，光照16 h/d。

经过反复试验，最终采用1/2MS + 0.5 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA+20%土豆汁诱导拟原球茎，分化培养采用1/2MS + 2.0 mg/L 6-BA + 1.5 mg/L NAA + 0.03 mg/L TDZ + 20%土豆汁，诱导生根选用1/2MS + 0.5 mg/L IBA，pH均为5.6。分3个不同发育时期采集样品：拟原球茎形成 (形成期)，拟原球茎有茎、叶分化 (分化期)，完整植株形成 (幼苗)。

1.2 试验方法

1.2.1 拟原球茎生长及植株再生过程中的微观形貌观察

获取形成期及分化期的拟原球茎，分别切取5块适当大小 (长 × 宽 × 高 ≤ 10 mm × 10 mm × 10 mm) 的样本，幼苗根、茎、叶样本来自5株生长较为一致的植株，分别取10 mm长的主根中部，5 mm长的茎中部，最末端一片叶的中心部位切取5 mm × 5 mm大小。样本装在铝盒里迅速投入液氮速冻固定[23]，约1.5 min后取出样本立即进行真空冷冻干燥48 h，干燥后的材料，表面经日本HITACHI E1010离子溅射仪喷镀黄金30 s，电流10 mA，使用美国FEI Quanta 200型扫描电镜观察微观形貌 (加速电压15～20 kV)。

1.2.2 拟原球茎生长及植株再生过程中的微区元素分析

拟原球茎形成期及有茎、叶分化期：用于扫描电镜观察的组织块，可同时使用英国OXFORD INCA X-Act 能谱仪进行微区元素分析，加速电压20 kV，分别选取5个不同部位，最终结果取平均值 (元素含量用质量百分比表示)[23]。

完整植株 (幼苗)：自然晾干后研磨成粉末状，经日本HITACHI E1010离子溅射仪喷镀黄金30 s，电流10 mA，使用能谱仪进行微区元素分析，加速电压20 kV，分别选取5个不同部位，最终结果取平均值 (元素含量用质量百分比表示)[23]。

2 结果与分析

2.1 拟原球茎生长及植株再生过程中的微观特征

霍山石斛拟原球茎诱导和再生植株不同发育时期的扫描电镜观察结果见图1。

无菌侧芽在经过筛选的培养基 (1/2MS + 0.5 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA+20%土豆汁) 上进行诱导，部分表层及表层下具有分生能力的细胞经多次分裂形成愈伤组织，愈伤组织最外层的薄壁细胞再分裂形成胚性细胞团，表面看上去结构致密，具球形颗粒 (图1-1)。随后，胚性细胞团的基部细胞开始分化伸长、增大，逐步失去分生能力，而顶端的细胞仍有活跃的分裂能力，持续不断地分裂和生长，使组织形成一些不规则的突起，这些突起逐渐长成卵圆形，形成拟原球茎 (图1-2)，在继代过程中，拟原球茎表面或内部薄壁组织中的一些胚性细胞分裂形成胚性细胞团后又可继续发育形成次生拟原球茎 (图1-3)。

1. 胚性愈伤组织；2. 胚性愈伤产生拟原球茎；3. 拟原球茎上产生次生拟原球茎；4. 叶原基的分化；5. 拟原球茎上分化的管状结构；6. 芽；7. 幼苗的根表面；8. 幼苗的根剖面；9. 幼苗的茎表面；10. 幼苗的茎剖面；11. 幼苗的叶表面；12. 幼苗的叶剖面。

图1 霍山石斛拟原球茎生长及植株再生

Fig.1 The development ofD.huoshanensePLBs and plantlet regeneration

随后的生长发育事件是极性的形成。拟原球茎逐渐呈现结构上的两极性，在靠近顶端处，其结构类似于茎，并在顶端形成叶原基后长出茎尖 (图1-4)。拟原球茎部分区域的表皮细胞形成不规则束状分布的管状突起 (图1-5)，其中一部分突起可以直接发育成芽 (图1-6)。经诱导生根形成完整植株，幼根直径在400～500 μm，没有发现根毛 (图1-7)，横剖面未见明显的根被组织，皮层、中柱结构清晰，皮层组织的薄壁细胞内含有丰富的颗粒物质，初生木质部和初生韧皮部排列紧密 (图1-8)。茎肉质，圆柱状，分节，每节中间稍粗，直径为800～1 500 μm，表面有较多纵向凹陷 (图1-9)，横剖面显示3部分构成：表皮，基本组织和维管束，周缘波浪状，细胞排列疏松，基本组织细胞腔清晰可见，细胞内含物黏液状，外韧有限维管束散生在基本组织中，呈不规则分布 (图1-10)。而叶没有观察到表皮毛结构，不具角质层，气孔只分布于下表皮，微突，多数张开，气孔平均密度约68.18个/mm2，气孔椭圆形，属四列型，保卫细胞肾形 (图1-11)，横剖面显示叶肉细胞呈近圆形或椭圆形，没有海绵组织和栅栏组织的分化，为等面叶，主脉处凹陷，叶的平均厚度193.49 μm，大小不等的叶脉维管束，相间排列于叶肉中，上表皮细胞柱形，下表皮细胞扁长，大小约为上表皮细胞的1/2，叶肉细胞腔内含有较多贮藏物质 (图1-12)。

霍山石斛组织培养过程中，发现拟原球茎在不同发育阶段，微观结构发生一系列特征性变化，不同时期具有不同的功能，体现出结构与功能的相互呼应，也为胚性细胞到完整植株的发育机制提供一定的理论依据。

2.2 拟原球茎生长及植株再生过程中的元素分析

应用能谱仪结合扫描电镜利用特征X射线对霍山石斛拟原球茎形成期、分化期及幼苗期 (完整植株) 3个时期体内一些元素进行原位的定性定量分析，具体数值见表1。

表1 元素含量比较

总体来说，由表1可知在拟原球茎发生初期、芽及完整植株的元素成分种类丰富，并且差异显著，均含有较多的Na、P元素，Na含量分别可达到12.00%、5.15%、6.19%，P元素次之，3个时期依次为7.60%、10.38%、3.14%，说明Na和P应该与拟原球茎的发生发育关系密切；而Mg元素在3个时期的含量均最少，随着生长发育依次仅为0.03%、0.03%、0.04%，并且差异不显著。

同一种元素在不同时期的含量变化也各不相同。Na、S、K 3种元素在发育初期含量较高，芽的分化期含量分别减少57.08%、17.95%、38.46%，生根幼苗的Na、S含量略有回升，但K含量增长幅度较大，为初期含量的1.65倍；而P、Cl、Mn 3种元素则在分化期含量增多，增幅分别为36.58%、137.5%、57.14%，Cl元素尤为显著，幼苗期P、Cl下降，Mn则继续增长了45.45%；Al、Si、Fe 3种元素的含量随着生长发育而呈现递减的态势；Ca元素在芽期比拟原球茎发育初期增长了50%，而幼苗期高达0.99%，比芽期又增长了43.48%。

总之，在拟原球茎发生初期，组织含有较多的Na、S、K、Al、Si、Fe，芽分化期P、Cl、Mn、Ca增多，Na、S、K、Al、Si、Fe减少，而形成完整植株后， K、Ca、Mn大量增多，分别比初期增长了65.38%、115.22%、128.57%，其他元素减少或者变化不明显。

3 结论与讨论

3.1 拟原球茎生长及植株再生过程中微观结构的生理性变化

现已报道多种石斛，如鼓槌石斛 (Dendrobiumchrysotoxum)[24]、铁皮石斛 (Dendrobiumcandidum)[25]和霍山石斛[26]等，其快速繁殖都经历3个阶段：愈伤组织再生、胚胎发生和器官发生，即从愈伤组织经拟原球茎到植株形成的过程。石斛组织培养的外植体通常选择种子、假鳞茎段、茎节、茎尖、苗端等，在适当条件下，一方面可以获得大批丛生苗；一方面利用拟原球茎的分化与增殖进行大量培养[14]。兰科植物组织培养中通过诱导适宜的外植体产生的拟原球茎类似于原球茎结构，也即体细胞胚胎，具有和植株同样的物质代谢和形态发育潜能，且生长速度快[27]。

许多报道一致认为PLBs是由外植体薄壁细胞经脱分化而形成的分生组织细胞发育成的胚性细胞进一步形成，其继续增殖分化长成幼苗[20-22]。本课题在研究过程中也发现外植体部分表层及表层下具有分生能力的细胞经多次分裂形成愈伤组织，而愈伤组织胚性细胞团顶端的细胞不断分裂和生长使整个组织形成不规则的突起，这些突起逐渐长成圆形或卵圆形的结构，即为PLBs。SEM的观察同时也验证了PLBs强大的增殖能力，PLBs在继代过程中会不断分裂增殖产生新的PLBs，与Hossain等[27]报道的原球茎一样，可以不断增殖产生次生原球茎 (secondary protocorms)。PLBs随着发育会逐渐显示出它结构上的两极性，茎尖先突起，形成具有茎叶系统的幼芽后，顶端分生组织下方的原形成层分化成维管柱，表皮薄壁细胞分化出不定根，完成幼苗的形态建成[26]。PLBs到幼苗的形成过程中，通过电镜观察还发现PLBs部分区域的表皮细胞会形成不规则束状分布的管状突起, 其中一部分突起直接发育成芽，这点与詹忠根等[20]描述的中国兰极为相似。

诱导生根后的完整植株，经过30 d的壮苗培养，通过SEM的观察，根表皮没有发现根毛，剖面显示无髓，并且没有根被，而杨静等通过SEM观察发现霍山石斛试管苗在移栽后才具备明显的根被组织[28]。根被由厚壁死细胞组成，细胞壁木栓化，主要起保护、吸水、透气和储藏水分的功能[29]，Morris[30]的研究表明附生兰根被细胞的层数和厚度明显会受环境湿度变化的影响，所以本研究认为试管苗的根由于处于形成发育的早期，并且生长在水分充足的环境中，不具备形成根被的条件。茎表皮多有纵向皱褶，横切面为圆形，边缘具波状棱角，维管束为外韧有限维管束，散生，叶为等面叶，气孔只分布于下表皮，四列型，保卫细胞肾形，这些与黎明等[31]对霍山石斛营养器官解剖结构的报道完全一致。在SEM下，从切面发现根细胞内含物呈分散的颗粒状，茎细胞腔内物质却明显呈黏液状，而同时期生理指标测定显示茎内含有大量多糖，根内较少，因此推测内含物的存在形态与物质种类有关。

对于霍山石斛来说，组织培养获得幼苗固然重要，但试管苗能否正常发育以及是否适合脱瓶移栽依然是资源能否得到良好保存的关键步骤，本试验通过对微观结构的观察，以期为试管苗的正常发育以及成功移栽提供形态学依据。

3.2 拟原球茎生长及植株再生过程中所含元素的变化

自然界中的非生物及生物均由化学元素构成。生物体含有多种元素，它们有些是机体进行生命活动的物质基础，有些是组成细胞的重要成分。本试验测得霍山石斛从拟原球茎时期发育到完整植株，最基本的C、O除外，每个时期均含有Na、Mg、S、P、K、Al、Si、Fe、Mn、Ca元素。Fe、Mn为人体所需的微量元素，Mn参与肌体的代谢，Fe是构成过氧化氢酶的重要成分，也是很多酶的活性部分[32]。Na、Mg、S、K、Al、Si、Ca属于人体的常量元素，在体内所占比例较大，是构成有机体的必备元素，其中Mg、K 还有利于提高氨基酸的含量[33]，C、O、S、P等元素组成人体糖类、蛋白质、脂肪、生长因子、辅酶以及激素等物质，可谓重要的基本组成元素。在中草药药理活性物质的研究中，人们发现元素在不同程度上协同发挥抗氧化、抗衰老、提高免疫力等各种功效[34]。因此推测某些元素成分很可能会与霍山石斛的神奇药效有着密切的关系。

随着霍山石斛拟原球茎的发育，机体所含元素的种类及含量呈现动态变化。在拟原球茎发生初期，组织含有较多的Na、S、Mg、K、Al、Si、Fe，而芽分化期P、Cl、Mn、Ca含量显著增多。报道[33,35]认为适量的金属元素，如Ca、Fe、Mn等将利于拟原球茎的生长或拟原球茎多糖和生物碱的生成。因此其元素的变化不仅体现出不同发育时期的生理需要，而且可能会间接促进一些有效成分的积累，从而奠定药效的物质基础。完成幼苗的形态建成之后，K含量回升并且远高于拟原球茎发生初期，Ca、Mn持续增多。K有助于神经系统传达信息，并且与Na、Cl一起能使体液维持接近中性，决定组织中水分的多少，属于机体生命所需的大量元素，Ca为生物必需，是含量最多的无机盐组成元素，参与新陈代谢，其含量不足则严重影响生长发育[36]。Mn是人体必需的微量元素，尽管在人体内含量极少，但对人体健康起着不可替代的重要作用[32,36-37]。许多研究者把中药功效的物质基础分为二大类，一类是生物活性成分，另一类则是微量元素，认为药物达到归经部位是通过微量元素向病变部位的迁移、富集和亲和运动来实现的[38]。因此，幼苗期Mn元素的大幅度增加可能关系到幼苗的药用价值，当然这些还有待进一步验证。

通过比较霍山石斛拟原球茎生长及植株再生过程中所含元素的动态变化，发现某些元素成分与其形态建成存在一定的联系，也许可以作为调控形态建成的重要因素，同时了解到不同发育时期一些有益元素的积累特征，下一步将结合机体内多糖、生物碱、氨基酸、蛋白质等重要有效成分的变化进行综合分析，从而为监测霍山石斛拟原球茎植株再生过程中药用价值的研究提供理论参考。如果能够探索到与野生苗药效相当的组培产物，对于濒危药用资源的利用将具有长远的意义。

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(责任编辑 张 坤)

Changes in Micro-structure and Elements of Protocorm Like Bodies fromDendrobiumhuoshanenseDuring the Development and Plantlet Regeneration

Yang Jing1,2, He Fang3, Wang Ji4, Fang Yanming1, Dai Bin5

(1. Co-innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China, College of Biology and the Environment, Nanjing Forestry University,Nanjing Jiangsu 210037, China; 2. Advanced Analysis and Testing Center, Nanjing Forestry University, Nanjing Jiangsu 210037, China;3. College of Chemical and Enviromental Engineering, Jiaozuo University, Jiaozuo Henan 454000, China; 4. Nanjing Xiaozhuang University,Nanjing Jiangsu 210017, China; 5. College of Biology and Pharmaceutical Engineering, West Anhui University, Lu′an Anhui 237012, China)

In order to get better understanding of the growth and officinal components during the development of protocorm like bodies (PLBs) fromDendrobiumhuoshanenseand plantlet regeneration，changes in micro-structure and micro-area elements were analyzed by means of SEM and EDS. Cells which have the ability to divide from the surface of explants formed embryogenic callus in tissue culture when conditions were suitable. Embryogenic cells grew into PLBs and secondary PLBs after constant division. PLBs showed bipolarity gradually and produced buds and roots to form complete plants. After 30 days, root hair or velamina were not found in roots. Stems were characterized by several features such as surface longitudinal depressions, round cross sections with wavy edges, scattered external ductile finite vascular bundle and mucinous cells contents. Quadrilateral stomata only distributed in the lower epidermis of isobilateral leaves and the guard cells were like kidneys. And more Na, S, K, Al, Si and Fe were in PLBs, then the contents of P, Cl, Mn and Ca increased in differentiated PLBs, and the contents of Na, S, K increased in the complete plants while other elements were less or not changed significantly.

Dendrobiumhuoshanense, Protocorm Like Bodies (PLBs), plantlet regeneration, micro-structure, element

10. 11929/j. issn. 2095-1914. 2016. 06. 001

2016-03-02

江苏省林业三新工程项目 (lysx[2013]07) 资助；国家自然科学基金 (31200233) 资助。

方炎明 (1962—)，男，博士，教授，博士生导师。研究方向：植物发育生物学与环境生物学。Email: jwu4@njfu.com.cn。

S723

A

2095-1914(2016)06-0001-07

第1作者：杨静 (1980—)，女，博士，讲师。研究方向：植物发育生物学与生物电镜技术。Email: yjnjfu@126.com。