安徽省汉族人氨基糖苷类抗生素致耳聋患者基因突变的研究

徐 彬，余元勋，王迎新，李建平，刘 萍，张 立



安徽省汉族人氨基糖苷类抗生素致耳聋患者基因突变的研究

徐 彬，余元勋，王迎新，李建平，刘 萍，张 立

目的 研究安徽省汉族人氨基糖苷类抗生素致耳聋(AAID)患者基因突变与其非综合征性耳聋(NSHL)的关系，建立口腔黏膜细胞基因组DNA新一代基因测序法(NGS)。方法 由122例NSHL患儿及120 例健康儿童，取得口腔黏膜基因组DNA，应用NGS对GJB2、12S rRNA 基因测序。结果 口腔黏膜细胞的基因组DNA质量较好，能满足NGS 研究需要；在122例NSHL患者中，28例GJB2 基因突变，占耳聋患者的22.95%；10例12S rRNA基因突变，占耳聋患者的8.20%。120例健康儿童中，未发现基因突变(P<0.01)。结论 口腔黏膜细胞基因组DNA 的NGS检测法能用于检出安徽省汉族人AAID基因突变；在安徽NSHL患者中GJB2、12S rRNA基因突变有其一定的特点，能对安徽省汉族人AAID基因突变研究提供帮助。

口腔黏膜细胞；耳聋；突变；GJB2；12S rRNA

我国每年约有3万例先天性耳聋发病患者[1]。50%耳聋与遗传因素相关，为遗传性耳聋，由遗传因素、环境因素的共同作用而引发，包括非综合征型耳聋[(non-syndromic hearing loss,NSHL)，约占70%]、综合征型耳聋[(syndromic hearing loss,SHL)，约占30%]；已发现与NSHL相关的致病基因及其突变有一定异质性，与人群的种族、地区不同相关[2]。氨基糖苷类抗生素(aminoglycosides antibiotic,AmAn)使用中出现的听觉和前庭的损害常是不可逆的，可诱发氨基糖苷类抗生素致聋(aminoglycosides antibiotic induced deafness,AAID)[3-4]，与AAID相关的12S rRNA 基因突变，以C1494T、

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A1555G、nt961insC、nt961delT、Tnt1095C等突变较常见[5]；研究[6]表明，GJB2基因上至少有110余种突变，可能与NSHL相关，GJB2基因突变的携带率为3%。目前遗传性耳聋较常用的基因诊断方法包括基因芯片法、NGS法。该研究主要应用口腔黏膜细胞的DNA，经NGS法检测耳聋致病基因突变, 以便为进一步开展AAID相关研究提供技术支持，为临床合理治疗提供指导。

1 材料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 对象 安徽残联康复研究中心、安徽省优生优育遗传医学中心门诊NSHL患者共122例，其中男童75例，女童47例；120例健康儿童作为对照，其中男童71例，女童49例。

1.1.2 病史采集 采用问卷调查的方式, 由患者家属等填写。

1.1.3 纯音听阈测定 应用的全部仪器按国家标准校准。① 耳科检查：应用耳镜检查外耳道、鼓膜；② 纯音听阈测定：按照常规于静室内，采用丹麦Madsen502便携式听力计，根据WHO预防聋和听力损失项目方法(1997年), 应用上升法进行气导听阈测定，计算0.5、1、2、4kHz4个频率听阈平均值为纯音听阈；听力障碍者听力损失的具体分级如下：轻度听力损失：26～40dBHL；中度听力损失：41～60dBHL；重度听力损失：61～80dBHL；极重度听力损失：>81dBHL。

1.1.4 调查结果 122例患者均无亲缘关系，经体检排除遗传性SHL，否认有中耳炎、接触强噪音、外伤的病史, 耳科检查鼓膜正常, 无穿孔、充血、内陷；NSHL患者中，9例在3岁内用过庆大霉素(7例)、链霉素(2例)，29例孕期或生后用药情况不详，84例无耳毒性药物用药史；77例为先天性聋(生后3个月内确诊)，41 例为生后6个月内确诊, 4例为1岁以后听力下降；耳聋程度分布情况见表1。

表1 不同发病时期耳聋程度分布情况(n)

1.2 基因组DNA抽提

1.2.1 口腔黏膜细胞 取122例遗传性NSHL耳聋患者和120例健康人口腔黏膜细胞，制备细胞悬液，4 ℃保存；DNA抽提方法，按照本研究组已发表的文献[7]制备基因组DNA溶液。

1.2.2 PCR引物设计 设计时参考人类GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) 遗传性耳聋的序列, 并利用Premier 5.0软件设计，由上海生工公司合成，引物信息见表2。

表2 引物序列

1.3 PCR反应体系和条件 反应体系：Total 10 μl：polymerase 1 U；Primer forward (2 μmol/L)1 μl；Primer reverse (2 μmol/L)1 μl;DNA溶液1 μl; 10×buffer 1 μl;MgCl2(50 mmol/L)0.3 μl;dNTPs(10 mmol/L)0.2 μl；水补齐至10 μl。反应条件：Preheat，95 ℃ 5 min；PCR 40 cycles(95 ℃ 15 s；60 ℃ 20 s；72 ℃ 30 s)；72 ℃ 15 min，4 ℃ 保存。

1.4 PCR产物测序 测序 PCR的反应产物由华大生物科技公司检验中心进行荧光全自动基因DNA正/反向测序，分析相关基因DNA突变。

1.5 统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，耳聋组与健康对照组的基因DNA突变结果采用t检验进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。两种DNA标本来源的 DNA 基因检测结果一致性分析用Kappa检验，Kappa>0.75则两者一致性较好。

1.6 突变分析 122例耳聋患者和120例健康人基因DNA的测序结果，与由GenBank中获得的正常人相关基因DNA相应序列进行比对，分析突变情况。

2 结果

2.1 一般资料 NSHL患者122例，其中男童75例(61.48%)，女童47例(38.52%)；男女之比为1.596 ∶1；均自愿参加，签署知情通知书。患者就诊年龄在出生后2～8(3.21±4.22)岁，男童平均年龄(4.26±5.12)岁，女童平均年龄为(3.61±3.96)岁；不同发病年龄耳聋程度分布不同。见表1。120例健康儿童作为对照，其中男童71例，女童49例；年龄在出生后2～8(3.39±4.37)岁，男童平均年龄(4.38±5.05)岁，女童平均年龄为(3.23±3.57) 岁。

2.2 提取DNA 取口腔颊黏膜细胞，制备基因组DNA溶液，凝胶电泳均为一条带，达到检验DNA溶液的纯度；基因组DNA溶液，经紫外分光光度计检测，OD260/OD280均为1.8，纯度合格；基因组DNA溶液浓度为1 μg/μl。

2.3 新一代基因测序分析结果 122例遗传性耳聋患者及120 例健康对照人群口腔黏膜细胞的DNA的PCR扩增、新一代基因测序分析后结果如下：在122例NSHL患者中，GJB2基因发现14例nt 235 del C杂合或纯合突变，2例nt 235 del C+nt 299～300 del AT复合突变，1例nt 235 del C+nt 176 del 16复合突变，4例nt 299～300 del AT移码突变，3例nt 176 del 16杂合突变, 2例nt 538 C→T纯合突变, 2例nt 547 G→A纯合突变，28例GJB2 基因突变患者占耳聋组的22.95%。

在122例NSHL患者中，线粒体12S rRNA基因发现3例nt 961 insC(如第12例)、3例nt 961 del T(如第23例)、1例nt 961 del T+T nt1095 C(如第28例)、2例A nt1555 G(如第63例)、1例C nt1494 T(如第86例)，10例线粒体12S rRNA基因突变患者占耳聋组的8.20%,结果显示5种基因突变的相应测序部分截图见图1～5。120 例健康对照者未发现基因突变, 与耳聋组基因突变率差异有统计学意义(t=3.719,P<0.01)。

图1 患者第12例基因突变测序部分截图

男，4岁半，听力阈值90 dB,12S rRNA基因的961位点出现nt 961 insC的缺失，箭头指示突变位置

图2 患者第23例基因突变测序部分截图

男，3岁10个月，听力阈值95 dB, 12S rRNA基因的961位点出现nt 961 delTC的插入，箭头指示突变位置

图3 患者第28例基因突变测序部分截图

男，5岁，左耳听力阈值90 dB，右耳听力阈值95 dB, 12S rRNA基因的961位点出现nt 961 delT+T nt1095 C的复合突变，箭头指示突变位置

3 讨论

我国7岁以下的耳聋儿童约有80万例，常在应用氨基糖苷类抗生素后出现听力损失，大部分为重度耳聋，少部分为轻中度耳聋，造成了严重的社会问题；利用准确、低成本、高效率的耳聋基因诊断方法，早期发现、诊断耳聋发生的原因, 根据不同病因采取不同的干预措施，对耳聋儿童的生存质量意义重大。

图4 患者第63例基因突变测序部分截图

女，4岁，听力阈值90 dB, 12S rRNA基因1555位点的A突变为G，箭头指示突变位置

图5 患者第86例基因突变测序部分截图

女，6岁，听力阈值95 dB,12S rRNA基因1494位点的C突变为T，箭头指示突变位置

研究[8]显示，由口腔黏膜细胞提取基因组DNA，可应用于基因诊断。本研究结果表明，收集口腔黏膜细胞，抽取基因组DNA，可用于耳聋基因诊断，方法简易、方便。

GJB2基因常是非综合征型耳聋的致病基因, 其中约50%为常染色体隐性遗传性(DFNB)，约20%为常染色体显性遗传性(DFNA)；该基因位于DFNA3A基因座, 编码缝隙连接蛋白Cx26，表达于内耳上皮毛细胞等。GJB2基因突变后，突变Cx26可引发内淋巴液钾离子循环紊乱，能导致感音神经性耳聋，常表现为先天性、双侧对称的、非进行性重度耳聋；一般可见于新生儿听力筛查未通过的患儿，可被新生儿听力检查 + 基因诊断联合筛查发现。对中国2 063例耳聋患者进行研究[9]表明GJB2基因突变在NSHL患者的阳性率为14.9%，本研究结果阳性率为22.95%，包括nt 235del C、235 del C+nt 299～300 del AT 、nt 235 del C+nt 176 del 16、nt 299～300 delAT、nt 176 del 16、nt 538 C→T、nt 547 G→A, 分别占122例患者的11.48%、1.64%、0.82%、3.28%、2.46%、1.64%、1.64%； 其阳性率、分型情况与国内报道一致；nt 235del C、nt 299～300 delAT、nt 176 del 16 可能是安徽省NSHL患者中的GJB2 基因突变热点。

线粒体mtDNA 12S rRNA基因突变有母系遗传的特点，与耳毒性药物相关。研究[10]显示mtDNA 无组蛋白而裸露，在12S rRNA发生Ant1555G、Cnt1494T突变后，能使12S rRNA 在空间结构上与细菌16S rRNA 相似，易结合AmAn，能引发氧化磷酸化紊乱，减少产生 ATP，可毒性损伤内耳毛细胞，导致 AAID；后者对 AmAn 敏感，有时可一针致聋。研究[11]证实mtDNA Ant1555G 点突变是 AAID 遗传易感性的分子基础，其在中国汉族人NSHL患者中的携带率存在地域、种族的差异, 其在南京、福州、武汉[12-14]的NSHL患者的检出率分别为1.50%、0.67%、2.27%。本研究的检出率为1.64%，其差异可能与各地区使用AmAn的频率、基因突变检测方法等相关。研究[12]提示mtDNA Cnt1494T点突变的致病机制与Ant1555G 类似。本研究对安徽省122例耳聋患者筛查，检出1例Cnt1494T突变，检出率为0.82%。

线粒体nt 961 del T/insC是12S rRNA的nt 961位T的缺失和(或)C插入；可能是AmAn致聋的又一重要原因[3]；该突变位于12S rRNA 基因的第21、22 环之间，可改变12S rRNA空间结构，易与AmAn结合而引发中毒性耳聋。本研究在安徽省的122 例耳聋患者中检出3例nt 961 insC、3例nt 961 del T、1 例复合突变nt 961 del T+Tnt 1095 C，总检出率为5.74%，3种突变分别占122例耳聋患者的2.46%、2.46%、0.82%。T nt1095 C位于12S rRNA的第25螺旋，能导致线粒体mtDNA 空间结构改变，促进与AmAn的结合，引发氧化磷酸化紊乱，减少产生ATP，可毒性损伤内耳毛细胞，导致产生 AAID[15]。本研究显示1例复合突变nt 961 del T+Tnt1095C，可能与耳聋发病相关；复合突变导致的耳聋症状可能较重，但需进一步研究。本研究122例耳聋患者中，12S rRNA 基因的 Ant3243G、Ant7445G、Ant827G、Gnt7444A 等突变未检出。

本研究提示AmAn诱发的药物性耳聋在各年龄段均可出现，不能忽视线粒体基因突变的检测，特别是有AmAn用药史、母系家族遗传史的患者；12S rRNA基因突变携带者发现后，要再检查未耳聋的母系成员，可早期发现相同突变携带者，能对其进行用药指导，避免药物性耳聋的发生。本研究建立的常见聋病基因分型快速检测方法，能了解GJB2、12S rRNA等基因突变的情况，能提高基因突变检出率, 可为本地区耳聋遗传咨询和聋病基因筛查提供依据。

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AbstractObjectiveTostudytherelationshipofthegenemutationsofAnhuiHanpeopleaminoglycosidesantibioticsinduceddeafness(AAID)patientsandnon-syndromichearingloss(NSHL),andsetupnext-generationsequencing(NGS)oforalmucosalcellsgenomaDNA.MethodsFrom122casesofNSHLpatientsand120casesofhealthychildren,wegottheoralmucosalcellsgenomaDNAsandusingNGSsequencedGJB2,12SrRNAgenes.ResultsThegenomaDNAsoforalmucosalcellsweregoodqualityforNGSstudy.In122casesofNSHLpatients,wefoundGJB2genemutationsof28casea(22.95%),andfound12SrRNAgenemutationsof10casea(8.20%).In120casesofhealthychildren,wedidnotfindanymutation(P<0.01).ConclusionNGSsequencingmethodoforalmucosalcellsgenomaDNAcanbeusedfordetectingthemutationsofAnhuiHanpeopleAAID.ThemutationsofGJB2,12SrRNAgenesinAnhuiNSHLpatientshavesomedifferentcharictersandcanhelptostudythegenemutationsofAnhuiHanpeopleAAID.

Keywordsoralmucosalcell；deafness；mutation；GJB2；12SrRNA

Comparative study of abdominal imaging quality between mixed energy mode and mono-energy mode reconstruction on dual-energy spectral CT

Wei Wei, Deng Kexue, Zhao Yingming, et al

(DeptofRadiology,AffiliatedProvincialHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230001)

ObjectiveToevaluatethedifferenceofmixedenergymodeandmono-energymodereconstructionimagesonabdomenspectralCTimaging.MethodsAbdomenpre-contrastandcontrastenhancedCTscanswereappliedwithspectralCTonsixtypatients.Imageswerereconstructedbytwo-modes:QCmodeandMonomode.Thefollowingvariableswerecompared:signal-to-noise(SNR)ofliver,spleenandpancreas,contrast-to-noise(CNR)ofliver,spleenandpancreas.Twoexperiencedradiologistsevaluatedtheartifactlevelofimagesofthetworeconstructionmodes.ResultsComparedwithmixed-energymodeimages,70keVmono-energyimagesyieldedsignificantlygreaterSNRandCNR(P<0.05).Subjectivescoreof70keVmono-energyimageswashigherthanthatofmixed-energyimage(P<0.001).ConclusionInabdominalspectralCTimaging,mono-energyreconstructioncanprovidehigherqualityofimagesthanmixed-energyreconstructionandcanreplacemixed-energyimagesinclinicaldiagnosis.

abdomen;computedtomography;X-raycomputed;spectralCT;reconstructionmode

Research of genetic mutation in Anhui Han people AAID patients

Xu Bin,Yu Yuanxun,Wang Yingxin,et al

(AnhuiMedicalGeneticsCenterinAnhuiMedicalCollege,Hefei230061)

安徽高校省级自然科学研究项目(编号：KJ2014A128)

安徽医学高等专科学校省遗传医学中心，合肥 230061

徐 彬，男，副研究员，责任作者，E-mail：xb.1030@163.com

时间：2016-10-12 13:23:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20161012.1323.022.html

R 969.3

A

1000-1492(2016)11-1653-05

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.023

2016-06-22接收