A101/B301基因家系分析

张韦，王守燕，徐祥

滨州市中心血站，山东滨州256602

A101/B301基因家系分析

张韦，王守燕，徐祥

滨州市中心血站，山东滨州256602

目的研究ABO血型表型与基因型不符的家系，分析产生该现象原因。方法采用试管法对微板法筛查出的正反定型不符血样做进一步血型血清学分析进行亚型确认。对亚型样本进行血清学分析和DNA测序，测序结果用软件比对分析后确定其基因型。结果从9 278份AB型无偿献血者血样中检出AB亚型血样6例（检出率为6.5/万），其中AelB1例、AB34例、B(A)表型1例。1例AB3亚型个体，红细胞与标准抗-B血清凝集为1+混合视野，若按血清表现型可归为ABend；但是经基因测序其基因均为A101/B301，且父代和子代也均为典型B3亚型。结论ABO亚型确认应采用血型血清学、分子生物学和遗传学相结合的检测方法；B亚型基因与正常的A基因结合在一起表现为α-1,3D-半乳糖转移酶活性的降低，使B抗原表达量减弱。

ABO亚型；基因型；家系

ABO亚型是ABO血型抗原较弱的亚型或变异型，它具有明确的血清学特点,并且具备遗传基础。ABO亚型产生的主要原因是基因第6外显子或第7外显子发生了点突变，降低或改变了糖基转移酶的活性，导致抗原变异或弱表达，致使血型血清学表现为红细胞上抗原减弱、混合视野、血清中出现不规则抗体或抗体活性减弱，从而给血型鉴定工作和临床输血带来了困扰[1-4]。血型血清学反应相同的抗原，可以有不同血型基因表达，如血清学表型同为A3型或Ax型的ABO血型亚型，其ABO基因可能不同，称之基因异质性[5]。尽管ABO亚型出现的频率不高，检测过程复杂，但是临床意义很大，值得我们去深究。笔者在献血者血型鉴定中发现1例血型血清学ABend亚型，而基因分型为AB3的献血者，血型血清学表型与血型基因型不一致，现报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料

9 278份AB血型样本均来源于山东省滨州市2014—2015年无偿献血者,经献血者知情同意后，EDTA抗凝管采集静脉血5mL用于检测,去除重复样本，献血者身体健康检查按照2011年由中华人民共和国卫生部和中国国家标准化管理委员会联合发布的《献血者健康检查要求》GB18467-2011操作。

1.2试剂与仪器

单克隆抗-A、抗B试剂（批号20121018）；抗-H试剂（批号20130408）；ABO反定型用红细胞（批号20135 337）；血液基因组DNA抽提试剂盒（批号：M1218）Premix Tap（批号：A1301A）BigDye terminator V3.1Sequencing(批号：9700型PCR扩增仪和3730型DNA测序仪；TL-16R平板离心机。

1.3血型血清学检测

按照2006年中华人民共和国卫生部医政司颁布的《全国临床检验操作规程》第3版:246-269操作[6]。

1.4ABO基因第6、7外显子直接测序和单体型序列分析

具体操作步骤参照文献[7-8]。测序引物参照Olsson等设计的2对引物，分别对Exon6和Exon7进行扩增，测序引物见表1。

表1　第6、7外显子直接测序引物

2　结果

2.1血型血清学结果

从2014—2015年滨州市9 278份AB型无偿献血者血样中，检出AB亚型血样6例，AB亚型在AB型人群中的检出率为6.5/万，6例AB亚型标本分别为AelB1例、AB34例、B(A)表型1例。AB3亚型献血者中的1位先症者，男，40岁，2014年1月献血200mL，复检血型时发现正定型AB型，反定型A型。红细胞与标准抗-B血清凝集为1+混合视野，经血清学初步检测怀疑为ABend型。经献血者和其家庭成员知情同意后，用EDTA抗凝管采集其妻子、儿子、父亲、姐姐、外甥女采集静脉血5mL用于检测。血型血清学检测中，先症者和其姐姐红细胞与标准抗-B血清凝集均为1+混合视野，血浆中含抗-B抗体，血清学表型为ABend型，先症者父亲、儿子和外甥女均为典型B3亚型。这个家庭的血型遗传不符合孟德尔遗传规律，需做进一步分析和检测。家系成员血型血清学结果见表2。

2.2ABO基因直接测序分析

先症者父亲、儿子和外甥女第6和第7外显子直接测序结果显示：261位delG、297位A/G、526位C/G、657位C/T、703位G/A、796位C/A、803G位/C、930位G/A、1054位C/T、1096 G/A杂合，其基因型为B301/ O01；先症者和姐姐第6和第7外显子直接测序结果与B101标准序列相比，出现297A/G、476C/T、526C/G、657C/ T、703G/A、796C/A、803G/C、930G/A、1054位C/T、1096G/A杂合，有关序列信息，根据标本多态性位点情况，指定其基因型为B301/A102。B301基因与B101序列比较，在1054位出现C>T单碱基突变。

2.3ABO基因克隆测序分析

先症者样本克隆测序结果显示，1条单倍体为B301突变发生在1054位C>T,导致氨基酸第352位氨基酸由精氨酸（Arg）转变为色氨酸（Trp；）另一条单倍体为A102。基因测序结果见图1，家系遗传特征见图2。

图1　先证者基因测序结果

图2　家系图谱

3　讨论

混合视野凝集是B3亚型红细胞的明显特征，显微镜下观察，B3细胞与抗-B或抗AB血清孵育后出现一些被绝大部分游离的非凝集红细胞包围的数个红细胞形成的凝集块。若将凝集细胞去除，剩余的游离细胞再与抗-B血清反应，仍然出现混合视野凝集[9-12]。先症者和姐姐红细胞与抗-B凝集达不到3+混合视野，且还有较弱的抗-B抗体,若按血清表现型可归为ABend，基因型为A101/B301，经家系调查其父代和子代均为含有B301基因单体的B3亚型，故可确定其血型为AB3亚型。据报道，亚型人A1B3血浆中大多含有抗-B抗体[13-15]，致使正反定型不一致现象。日常的检测中一般都使用单克隆抗体血清检测，因单克隆抗体效价都很高，增加了与细胞的反应强度，如本家系中的3例B3亚型标本，先证者父亲、儿子、外甥女与单克隆血清反应均≥4+，与人源血清反应明显减弱。

表2　血型血清学反应格局

本家系测序结果表明，先证者与其姐姐的1054C>T突变来自他们的父亲，他们的孩子又遗传了该突变，符合孟德尔遗传规律。这一突变与B101序列比较，在1054位出现C>T,引起多肽链第352位精氨酸Arg被色氨酸Trp取代。色氨酸为非极性a氨基酸,而碱性的精氨酸是含有胍基的极性a氨基酸，生理条件下带正电荷。氨基酸替换打破了电荷平衡，造成了a-1,3-D-半乳糖基转移酶活性部分丧失，使B抗原合成量减少。

ABO亚型的确认不能单单从血清学或分子生物学改变上来判定，血型血清学表现一致的ABO亚型个体，其ABO亚型基因结构可能不同，ABO亚型基因相同的ABO亚型个体，血型血清学表现可能会不一致。本家系检出的2例AB3亚型个体，如果单单只做血型血清学试验，应当归为ABend亚型；但是他们的基因都是A101/B303，而且父代和子代均为典型B3亚型。台湾人Li L等曾报道父代Ax血型，子代与B基因结合在一起AxB加强为A3B[16]。由此笔者推断，个体基因的两条单倍体在转录过程中相互影响，A亚型基因与正常的B基因结合在一起表现为α-1,3-N-氨基半乳糖转移酶活性的增强，A抗原表达量增加；B亚型基因与正常的A基因结合在一起表现为α-1,3-D-半乳糖转移酶活性的降低，B抗原表达量减弱。

该研究标本量较少致使调查结果有些局限，如果能发展简单易操作的基因分型技术，使大多数血型工作者都能掌握该技术，可以搜集大量表型正常的标本一起做研究，就能更加确切的分析该地区ABO基因的遗传多态性，更精准地为临床患者进行血液配型工作，增加临床输血的安全性和有效性。

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Analysis of A101/B301 Gene Family

ZHANGWei,WANG Shou-yan,XU Xiang
The Blood Center of Binzhou City,Binzhou,Shandong Province,256602 China

Objective To research the gene family of ABO phenotype failing to match the genetype and analyze its cause. Methods The positive typing and reverse typing?unconformity blood samples screened out by microplate test were given the further blood group serology analysis for subgroup confirmation by the test tube method,and the subgroup samples were given the serological analysis and DNA sequencing,and the genetype was confirmed after analysis.Results 6 cases of AB subtype blood samples were tested from 9 278 cases of unpaid blood donors whose blood type was AB,and the detection rate was 65 per thousand,including 1 case whose blood type was AelB,4 cases whose blood type were AB3,and 1 case with B (A)phenotype,and 1 case with AB3 subtype,but all genes were A101/B301 after the gene sequencing,and the sire?generation and filial generation were the typical B3 subtype.Conclusion ABO subtype confirmation should adopt the blood group serology,molecular biology and genetics,and the manifestation of subtype B gene and normal A gene is α-1,and the decrease of 3D-galactose transferase activity weakens the B antigen expression level.

ABO subtype;Genetype;Gene family

R457.1

A

1672-5654（2016）11（b）-0063-04

10.16659/j.cnki.1672-5654.2016.32.063

2016-08-15）

张韦（1976-），女，山东滨州人，在职硕士在读，主管技师，主要从事输血质量控制和输血研究工作。