组胺分子印迹聚合物中模板分子制备比例的紫外光谱学研究

王帅帅，朱秋劲，2*

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025；2.贵州省农畜产品贮藏与加工重点实验室，贵州贵阳550025）

组胺分子印迹聚合物中模板分子制备比例的紫外光谱学研究

王帅帅1，朱秋劲1，2*

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025；2.贵州省农畜产品贮藏与加工重点实验室，贵州贵阳550025）

组胺广泛存在于各类食物当中，在利用组胺分子印迹聚合物传感器对组胺进行快速检测的过程中，模板分子与功能单体的配比对于最终合成的印迹聚合物的特异吸附能力影响显著。组胺和2-（三氟甲基）丙烯酸分别被选作模板分子和功能单体。为探究二者的配比，利用紫外光谱扫描的方法分别检测了组胺与2-（三氟甲基）丙烯酸的最大吸收峰，并通过差式紫外扫描以及对功能单体不同加入比例的紫外扫描，发现组胺与2-（三氟甲基）丙烯酸的比例至少为1∶4时才能形成稳定的预组装复合体系，而比例为1∶6时，最大吸收峰显著下降且最大吸收峰波长红移，整个体系达到最稳定的状态。所得的结果对于制备组胺分子印迹聚合物传感器对组胺进行快速检测有着较好的指导性意义。

组胺；分子印迹聚合物；模板分子-功能单体比例；紫外扫描

组胺（histamine，HA）是一种单胺类神经递质，也是一种十分常见的生物胺。其广泛地存在于各类生物体和食物中，尤其是大量存在于腐败或不新鲜的水产中[1]。实际上微量的组胺是人体必不可少的，有研究证明，微量的组胺能够参与人体中的多项生理调控[2-4]。但如果人体摄入了过量的组胺就会导致严重的组胺中毒反应，会产生如眩晕、头疼、呼吸窘迫等症状，抢救不及时甚至会危及生命[5]。传统的组胺检测手段主要采用的是高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）、气相色谱法（gas chromatography，GC）和毛细管电泳法（capillary electrophoresis，CE）等方法[6-9]。这些方法虽然经过了大量科研工作者地探索已较为的成熟，但是这些方法不可避免的都存在着诸如需要专业的大型仪器设备、对样品需要进行复杂的前处理或者需要有经验丰富的科研实验人员进行操作等弊端。而随着科学技术的不断发展，一种名为分子印迹的技术（molecularly imprinted technique，MIT）被创立出来[10]，该技术所制备出的分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs）由于拥有高度的特异吸附性、选择性以及可重复利用性而受到了众多科研工作者的关注。

分子印迹技术的原理是将某种特定的物质当作模板分子，也即是待检测物质，选取某种合适的材料作为功能单体。将模板分子与功能单体放入某种溶剂中并在一定的聚合条件下进行聚合，此时功能单体和模板分子就会通过共价键或非共价键的形式形成预组装复合物，再加上引发剂与交联剂的作用就能够固定住这种预组装物的结构而形成一种稳定的聚合物。之后将聚合物中的模板分子洗脱出来，该聚合物就会出现一个特异吸附该种模板分子的空腔，这种具有空腔的聚合物就被称作是分子印迹聚合物[11]。将分子印迹聚合物与某种传感器相连接就能够制备出检测该种物质的传感器，通过传感器就能直观、便捷、快速的对目标物质进行检测。而分子印迹聚合物所拥有的这种高度特异吸附性主要取决于聚合物中共价键和非共价键的数目及位置，也体现了模板分子和功能单体比例的重要性。如果功能单体比例过低，所形成的印迹聚合物结构稳定性差，对模板分子的吸附主要依赖于非特异性吸附，这就会导致印迹聚合物的特异吸附能力不高，制备出的传感器则会出现假阳性结果。而如果功能单体的比例过高，由于空间位阻作用导致模板分子无法被洗脱，并且难以出现稳定的聚合物构象，同样无法制备出有效的分子印迹聚合物。故而确定模板分子与功能单体的比例对于制备出有效的分子印迹聚合物至关重要。传统的配比比例探究方法通常采用大量的重复试验来对各个比例逐一进行制备和检测，但这样不仅耗时耗力，同时也有着巨大的实验消耗[12]。

这项研究就是在拟制备组胺分子印迹聚合物对组胺进行快速检测的过程中，为了确定模板分子与功能单体的比例而对模板分子-功能单体的预组装复合物进行紫外光谱学研究。在功能单体的选择上，对于分子印迹聚合物报道应用得最多的功能单体是甲基丙烯酸[13-14]（methacrylic acid，MAA），但制备出来的印迹聚合物特异选择性并不都很好。而由于2-（三氟甲基）丙烯酸（2-（trifluoromethyl）acrylic acid，TFMAA）具有较强的吸电子效应，能够更好地形成稳定的氢键结构[15-16]，并且将2-（三氟甲基）丙烯酸应用在组胺分子印迹聚合物的制备上尚未见报道，所以选取2-（三氟甲基）丙烯酸作为功能单体。

组胺与2-（三氟甲基）丙烯酸的分子结构式如图1所示。在组胺分子的结构中拥有一个五元杂环可产生吸收峰，并且其末端还含有一个氨基，在这个氨基上面的孤对电子可受到紫外的激发而发生n→δ*跃迁至反电子轨道上产生吸收峰。而在2-（三氟甲基）丙烯酸中也因为拥有一个碳氧双键作为发色基团可产生吸收峰。

图1 组胺(A)与2-(三氟甲基)丙烯酸(B)的分子结构Fig.1 Molecular structure of histamine(A)and 2-(trifluoromethyl) acrylic acid(B)

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

组胺（纯度≥97%）、2-（三氟甲基）丙烯酸（纯度98%）：美国Sigma-Aldrich公司；氯仿（分析纯）：重庆川东化工有限责任公司。

1.2 仪器与设备

LRH-150恒温培养箱：上海一恒科技有限责任公司；SB-100D超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限责任公司；CP214型电子分析天平：上海奥豪斯仪器有限责任公司；TU-1810型紫外-可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 实验方法

模板分子及功能单体紫外光谱测定：首先分别配制6 mmol/L的组胺-氯仿溶液和相同浓度的2-（三氟甲基）丙烯酸-氯仿溶液，之后吸取600 μL的组胺-氯仿溶液至10 mL的容量瓶中，用氯仿溶液精准定容至10 mL，超声波混匀15 min后放置在5℃恒温培养箱中12 h。之后以氯仿溶液作为参比溶液，使用紫外-可见分光光度计在波长190～400 nm的范围内进行扫描，扫描间隔1 nm。2-（三氟甲基）丙烯酸-氯仿溶液也采用相同方法进行实验。

不同功能单体与模板分子比例形成的预组装复合体系紫外光谱测定：分别配制6 mmol/L的组胺-氯仿溶液和相同浓度的2-（三氟甲基）丙烯酸-氯仿溶液。于1～10号10 mL的容量瓶中分别加入600 μL的组胺-氯仿溶液，然后在1～10号容量瓶中分别加入不同量6 mmol/L的2-（三氟甲基）丙烯酸-氯仿溶液配制出10种不同组胺与2-（三氟甲基）丙烯酸比例的溶液，比例分别为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9和1∶10。用氯仿溶液精准定容至10 mL，超声波混匀15 min后放置在5℃恒温培养箱中12 h。以6 mmol/L的组胺-氯仿溶液作为参比，使用紫外-可见分光光度计在波长190～400 nm的范围内进行扫描，扫描间隔1 nm。

另取6个10 mL的容量瓶，分别加入600 μL的组胺-氯仿溶液，之后再加入不同量6 mmol/L的2-（三氟甲基）丙烯酸-氯仿溶液分别配制出组胺与2-（三氟甲基）丙烯酸的比例为1∶2、1∶4、1∶5、1∶6、1∶8和1∶10的溶液。使用氯仿溶液准确定容至10 mL，超声波混匀15 min后放置在5℃恒温培养箱中12 h。分别以相同浓度的2-（三氟甲基）丙烯酸溶液作为参比在波长190～400nm的范围内进行扫描，扫描间隔1nm。

2 结果与分析

2.1 组胺与2-（三氟甲基）丙烯酸的最大吸收峰测定

组胺与2-（三氟甲基）丙烯酸的紫外光谱扫描结果如图2所示。

由图2可知，组胺与2-（三氟甲基）丙烯酸的最大吸收峰分别出现在波长244 nm和245 nm处。

图2 组胺与2-(三氟甲基)丙烯酸的紫外光谱图Fig.2 UV spectra of histamine and 2-(trifluoromethyl)acrylic acid

2.2 差式紫外扫描以及对功能单体不同加入比例的紫外扫描

对于模板分子与功能单体形成的预组装复合物，首先可以通过实验检测反应前后吸光度值的变化程度来对复合物的稳定程度进行一个预估，称为差式紫外扫描[17]。组胺与不同比例的2-（三氟甲基）丙烯酸的差式紫外扫描结果见图3。

图3 组胺与不同比例的2-(三氟甲基)丙烯酸的差式紫外光谱图Fig.3 Differential UV spectra of histamine with various 2-(trifluoromethyl)acrylic acid ratios

由图3可知，发现组胺与2-（三氟甲基）丙烯酸的比例至少为1∶4时才能形成稳定的预组装复合体系。

对于组胺与2-（三氟甲基）丙烯酸形成预组装复合物这个反应而言，可用公式（1）来表示。

式中：H为组胺，T为2-（三氟甲基）丙烯酸，n为反应的比例，K为反应的平衡常数。

如设组胺和2-（三氟甲基）丙烯酸的初始浓度分别为a、b，复合物的浓度为c，在2-（三氟甲基）丙烯酸的浓度大于组胺浓度的情况下，平衡常数K可表示为公式（2）。

基于光的加和性质，根据Lambert-Beer定律，反应前后吸光度值的变化程度可表示为公式（3）。

式中：ΔA为吸光度值的变化，εH、εT、εH-T为组胺、2-（三氟甲基）丙烯酸和二者复合物的摩尔吸光系数，l表示样品光程。

将公式（3）带入公式（2）中通过整理可得出公式（4）。

式中：Δε为预组装复合体系与各部分之间摩尔吸光系数的差值。

对于分子印迹聚合物而言，聚合物中氢键的数目越多，聚合物的特异性吸附能力越好[19-20]，而组胺与2-（三氟甲基）丙烯酸的反应就能产生不同数目的氢键。基于光的加和性，如果两种物质不发生反应，那么其混合溶液的吸光值理论上就应该等于两种物质各自的吸光度值的数学加和[21]，如果二者发生反应，则吸光值就会产生不同程度的变化，反应后吸光值的变化越明显即代表所生成的复合物特异性吸附能力越好。组胺与不同比例的2-（三氟甲基）丙烯酸反应所生成的预组装复合物的紫外光谱图见图4。本部分实验中，基于差式紫外扫描的结果对实验进行了合理的优化，选择性的挑选了1∶4、1∶5、1∶6、1∶8、1∶10这6种比例进行实验。

从图4可明显的发现，当组胺与2-（三氟甲基）丙烯酸的比例为1∶6时最大吸收峰下降的程度最大，并且最大吸收峰产生了红移，其他比例下的图像变化不明显。说明在此比例条件下时，组胺上的N原子与2-（三氟甲基）丙烯酸上的羧基形成了最多的氢键且所形成的预组装复合体系拥有最大的稳定性。

图4 组胺与不同比例的2-(三氟甲基)丙烯酸反应的复合物紫外光谱图Fig.4 UV spectra of histamine with various 2-(trifluoromethyl) acrylic acid ratios

3 结论

通过对组胺以及2-（三氟甲基）丙烯酸进行紫外光谱扫描发现，组胺的分子结构中由于含有一个五元杂环以及末端含有一个氨基，所以受紫外激发能够产生最大吸收峰。2-（三氟甲基）丙烯酸也由于其分子结构中含有一个碳氧双键作为发色基团而能产生最大吸收峰。二者的最大吸收峰分别出现在波长244 nm和245 nm处。

通过对组胺以及2-（三氟甲基）丙烯酸的分子结构进行分析，加上差式紫外扫描发现，1 mol的组胺要与4 mol的2-（三氟甲基）丙烯酸才能形成稳定的预组装复合体系。而通过2-（三氟甲基）丙烯酸的不同加入量与组胺反应进行紫外光谱扫描发现，当组胺与2-（三氟甲基）丙烯酸的比例为1∶6时，体系的最大吸收峰产生明显的下降，最大吸收峰出现的波长也产生红移，所以在该比例下二者形成的预组装复合体系呈最稳定的状态。

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Ultraviolet spectrum research of the preparation ratio of template molecule in histamine molecularly imprinted polymers

WANG Shuaishuai1,ZHU Qiujin1,2*
(1.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 2.Key Laboratory of Agricultural and Animal Products Store and Processing of Guizhou Province,Guiyang 550025,China)

Histamine commonly exists in various foods.In the rapid detection process of histamine using histamine molecularly imprinted polymers sensor,the ratio of template molecule and functional monomers has distinct influence on the specificity adsorption capacity.Histamine and 2-(trifluoromethyl)acrylic acid were selected as template molecule and functional monomer respectively.For exploring the most appropriate ratio,the ultraviolet spectrum was used to detect the maximum absorption peaks of histamine and 2-(trifluoromethyl)acrylic acid respectively.Furthermore,differential ultraviolet spectra and ultraviolet spectra were used to various functional monomer with different ratios.Results showed that the pre-assembly system got stable at the ratio of 1∶4,and the most stable situation was aquired at the ratio of 1∶6 with the decrease of the maximum absorption peak and the red shift of wavelength.The results showed a definite guidance for manufacturing histamine molecularly imprinted polymers sensor to the histamine rapid detection.

histamine;molecularly imprinted polymers;template-monomers ratio;ultraviolet spectrum

O657.32

0254-5071（2016）11-0149-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.031

2016-08-04

国家自然科学基金资助项目（31160324）；贵州省研究生工作站项目（黔教研合JYSZ字[2015]009）；贵州省研究生卓越人才计划（黔教研合ZYRC字[2014]003）

王帅帅（1991-），男，硕士研究生，研究方向为食品营养与安全。

*通讯作者：朱秋劲（1969-），男，教授，博士，研究方向为畜产品加工及贮藏。