太白蓼多糖的硫酸化修饰及其体外抑菌活性分析

安 乐，赵秋云，覃裴溪，翁茂洋，陈 蕾，柯金鹏，张为民，卿素珠

(西北农林科技大学 动物医学院，陕西杨凌 712100)



太白蓼多糖的硫酸化修饰及其体外抑菌活性分析

安 乐，赵秋云，覃裴溪，翁茂洋，陈 蕾，柯金鹏，张为民，卿素珠

(西北农林科技大学 动物医学院，陕西杨凌 712100)

建立并优选太白蓼多糖(PolygonumtaipaishaneaseKung polysaccharide ,PTKP)硫酸化修饰的条件，探讨硫酸化修饰对太白蓼多糖抑菌活性的影响。以硫酸根取代度为指标，采用氯磺酸-吡啶法对太白蓼多糖进行修饰，以氯磺酸-吡啶比、反应时间和反应温度为因素水平，采用L9(34)正交试验对修饰条件进行优选。用氯化钡-明胶浊度法测定修饰产物的硫酸基取代度(DS)，傅里叶红外变幻光谱法测其结构，微量法测定硫酸化太白蓼多糖(sulfatedPolygonumtaipaishaneaseKung polysaccharide,sPTKP)对大肠杆菌和志贺氏菌的最小杀菌浓度。太白蓼多糖硫酸化修饰的最佳条件为氯磺酸与吡啶体积比为1∶10，反应温度为80 ℃，反应时间为1 h，sPTKP的硫酸基取代度为1.57。红外光谱检测到S=O的伸缩振动峰。PTKP和sPTKP对大肠杆菌和志贺氏菌均有抑制作用，它们对志贺氏菌的抑制作用优于大肠杆菌。 硫酸化修饰能提高太白蓼多糖对大肠杆菌和志贺氏菌的体外抑菌活性。

太白蓼多糖；硫酸化修饰； 正交试验； 体外抑菌

中药多糖具有重要的免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗癌、抗糖化、抗炎等免疫药理学作用，且毒副作用小、无残留、不产生耐药性[1]。近年来的研究显示，中药多糖经分子修饰后其药理活性有所增强，而硫酸化修饰是中药多糖分子修饰方法中应用最广泛的，也是最普遍的一种修饰方法。目前，一般采用氯磺酸-甲酰胺[2]、氯磺酸-吡啶法(Wolfrom法)[3]、浓硫酸法[4]、三氧化硫-吡啶法[5]、三氧化硫-三甲胺盐[6]等对中药多糖的支链残基进行硫酯化修饰。研究表明，经硫酸化分子修饰后，中药多糖的免疫调节、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤等生物活性明显增强[7]。

太白蓼(PolygonumtaipaishaneaseKung)，又名大红粉，为陕西特有中草药资源之一，始载于“图经本草”，属于太白“七药”之一[8]，太白蓼的根茎具有清热解毒、止血等功效，民间常用于治疗疟疾腹泻、吐血、血崩、白带、外伤出血等病症。张为民等[9]的研究发现，太白蓼乙酸乙酯部位(PTKE)及其分离物EB对鸡新城疫病毒在鸡胚成纤维细胞的增殖具有抑制作用，并对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌、多杀性巴氏杆菌和无乳链球菌均有一定的体外抑制作用；进一步研究[10]证实，太白蓼乙酸乙酯提取物具有明显的抗腹泻和抗炎作用，促进雏鸡免疫器官发育及淋巴细胞的增殖，具有一定的体外抑制大肠埃希菌和沙门氏菌的作用，并对新城疫病毒在鸡胚内增殖具有一定的抑制作用。体外试验结果[11]证实，太白蓼提取物对猪传染性胃肠炎病毒在猪睾丸细胞(ST)内增殖具有显著的体外抑制作用。梁波等[12]的研究表明，太白蓼挥发油对所选的大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等8种细菌具有一定的体外抑制作用。而有关太白蓼多糖的分子修饰及分子修饰后药理作用等方面的研究尚未见报道。本试验采用氯磺酸-吡啶法对太白蓼多糖(PolygonumtaipaishaneaseKung polysaccharide,PTKP)进行硫酸化修饰，正交试验对修饰条件进行优化，傅立叶红外光谱测定修饰产物的结构，并通过体外抑菌试验观察硫酸化太白蓼多糖(sulfatedPolygonumtaipaishaneaseKung polysaccharide,sPTKP)对大肠杆菌与志贺氏菌的抑制作用，为太白蓼资源的开发和综合利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试中药 太白蓼块根由陕西省眉县金渠药材分公司太白山草药研究所卫拉船中药师鉴定并提供。

1.1.2 供试细菌 大肠埃希菌(E.coli)和志贺氏菌(Shigellosis)由西北农林科技大学兽医微生物实验室从患乳房炎奶牛乳汁中分离、鉴定并保存。

1.1.3 主要仪器与试剂 试验用仪器有循环水多用真空泵、旋转蒸发仪、自动平衡离心机、冷冻干燥机、紫外分光光度计、傅立叶红外光谱仪。

所用药剂有氯磺酸、葡萄糖、明胶、苯酚、吡啶、乙酸、氯化钡、浓盐酸、硫酸钾、三氯乙酸、无水甲酰胺和氢氧化钠等均为国产分析纯。

1.2 方 法

1.2.1 太白蓼多糖的制备 太白蓼多糖的提取(水煎醇沉法)：将太白蓼粉碎，称取116.5 g，加蒸馏水煎煮2～3次，每次煎煮时间为20 min，趁热用纱布过滤除去药渣，合并滤液，减压浓缩至145 mL；浓缩滤液经5 000 r/min离心15 min，取上清液，加入无水乙醇，使乙醇体积分数最终达到80%，静置过夜后过滤，弃去滤液，所得沉淀物加热烘干即得PTKP粗品。用下式计算PTKP的得率：PTKP得率=多糖质量/太白蓼样品质量×100%

多糖浓度的检测：得到的PTKP采用苯酚-硫酸法[13]检测多糖的浓度。

1.2.2 正交试验优化氯磺酸-吡啶法制备硫酸化太白蓼多糖 硫酸化反应各因素水平的确立 根据文献[13]，反应温度、试剂比例、反应时间对修饰的影响较大，因此选取反应温度(A)、氯磺酸与吡啶的配比(B)和反应时间(C)为因素，确立3个水平，见表1。

sPTKP的制备：将带有搅拌和冷凝装置的三颈烧瓶置冰盐浴中，按照表1设定的试剂配比加入预冷的无水吡啶50 mL，搅拌使之冷却，再将氯磺酸40 min内逐滴加入，共制得9种酯化试剂。称取500 mg的PTKP置于100 mL的无水甲酰胺中搅拌均匀，加入酯化试剂，按表1设定的反应时间和温度在水浴中搅拌反应。反应完成后，将反应产物加入到100 mL预冷的蒸馏水中，用质量分数为0.5 %的NaOH调节pH至7.0，用3倍体积的无水乙醇沉淀静置24 h。取沉淀装入透析袋，用自来水透析48 h，蒸馏水透析24 h。透析液经冷冻干燥得sPTKP，共9种。

表1 正交试验筛选制备sPTKP的条件

1.2.3 sPTKP的鉴定 硫酸基的定性：采用傅立叶变换红外光谱法。PTKP硫酸化修饰后结构上具有特殊的C-O-S和C-O-SO3基团，取多糖各3 mg，采用常规KBr 压片法,在红外光谱仪上测定4 000～400 cm-1的红外光谱，分析光谱图。

硫的定量(氯化钡-明胶法)： 采用氯化钡-明胶浊度法[13]测定样品的硫酸根含量。硫酸基取代度(degree of sulfation,DS)是指多糖中每个糖单位上的活性羟基被硫酸根所取代的数量，按下式计算：DS= (1.62×S% ) / (32-1.02×S%)，其中S%为硫质量分数。

1.2.4 PTKP和sPTKP的体外抑菌试验 琼脂扩散法抑菌试验：将PTKP和sPTKP分别配成质量浓度为20 mg/mL的溶液，并以灭菌生理盐水作为空白对照。在无菌条件下，用灭菌L型玻璃棒将各种细菌均匀涂抹在直径为90 mm的琼脂平板上，用直径为4 mm的打孔器打孔，分别在孔内加入灭菌生理盐水、PTKP和sPTKP，于37 ℃培养18～24 h，测定不同供试液的抑菌圈直径。重复3次，取平均值。

最小杀菌质量浓度(Minimum Bactericidal Concentration,MBC)的测定：将PTKP和sPTKP分别配成质量浓度为80 mg/mL的药液。采用2倍稀释法，在无菌条件下，取无菌试管11支(规格为15 mm × 100 mm)，每管加入肉汤1 mL，在第1管中加入药液1 mL，连续倍比稀释到第8管，并从第8管弃去1 mL。第9、10、11管分别为药物对照组(不加细菌)、细菌生长对照组(不加药液)和肉汤对照组(不加细菌和药物)。除第9和11管外，其余每管均加入细菌悬液25 μL。接种完成后，于37 ℃培养18～24 h，重复3次。吸取各试管培养液各100 μL，用灭菌L型玻璃棒将细菌均匀涂抹到琼脂平板上，于37 ℃恒温培养18～24 h，以菌落数不超过5个的最低提取物质量浓度为该提取物的MBC。

2 结果与分析

2.1 太白蓼多糖浓度测定结果

用水煎醇沉法提取太白蓼，所用太白蓼为116.5 g，所提取得到的太白蓼多糖为15.3 g，多糖的得率为13.1%。在490 nm处测各葡萄糖标准管的吸光度值，以葡萄糖浓度为横坐标(x),吸光度值为纵坐标(y)，回归处理得直线方程为y=3.031 4x-0.011 9,R2= 0.970 8。0.06 g/L 的PTKP溶液在490 nm处的吸光度值为0.141。计算得PTKP的质量分数为88.6%。

2.2 正交试验结果

2.2.1 sPTKP硫酸基取代度的测定 在紫外可见分光光度计下，测定各硫酸钾标准管在360 nm处的吸光度，以硫酸根质量浓度为横坐标(x)，吸光度A为纵坐标(y)，回归处理0得直线方程为y=2.065 0x-0.015 4,R2=0.997 1。见图1。 2.2.2 正交试验优化氯磺酸-吡啶法制备硫酸化太白蓼多糖的结果 以温度、氯磺酸与吡啶比率、反应时间为因素进行正交试验，结果如表2所示。

图1 硫酸根质量浓度的标准曲线

表2 正交试验筛选制备sPTKP的结果

由表2可以看出，各因素的作用表现为C> A > B，即时间对硫酸基取代度影响最大，其次是反应温度和酯化试剂比率。由K值可知最佳组合为A2B3C1。因此，确定最佳的硫酸酯化工艺条件为：酯化试剂体积比为1∶10，反应温度为80 ℃，反应时间为1 h。

2.3 红外光谱测定结果

PTKP和sPTKP的傅里叶红外光谱扫描结果见图2和图3。由图可知，在PTKP红外光谱的3 600～3 200 cm-1处有1个OH的伸缩震动吸收峰，1 400～100 cm-1处有C-H震动吸收峰，证明样品是多糖；在sPTKP的红外光谱上，除了有多糖的吸收特征外，还有1个特征吸收峰，1个在1232.57 cm-1为不对称S=O伸缩震动引起的，证明硫酸基已经被酯化到太白蓼多糖上。

图2 PTKP红外光谱

2.4 体外抑菌试验结果

通过琼脂扩散法可知PTKP和sPTKP对大肠杆菌和志贺氏菌均有抑制作用，PTKP和sPTKP对志贺氏菌的抑制作用高于大肠杆菌，且sPTKP对受试菌株的抑制作用高于PTKP。最小杀菌质量浓度测定结果如表3和表4所示，由表可知，PTKP对志贺氏菌和大肠埃希菌的最小杀菌质量浓度分别为20 mg/mL和40 mg/mL；sPTKP对志贺氏菌和大肠埃希菌的最小杀菌质量浓度分别为10 mg/mL和20 mg/mL。表明PTKP经硫酸化修饰后提高了其抑菌活性。

图3 sPTKP红外光谱

表3 PTKP和sPTKP对大肠杆菌的抑菌环直径

表4 PTKP和sPTKP对志贺氏菌抑菌环直径

3 讨 论

目前，常用的人工合成硫酸酯多糖的方法包括氯磺酸-吡啶法、浓硫酸法、三氧化硫-吡啶法等，其中氯磺酸-吡啶法因试剂简单易得，反应条件也相对简单，取代度较高，产物回收方便，成为最常用的方法。不同的多糖，因其分子质量以及多糖分子的空间结构不同，所以硫酸化的最优条件不同，最优条件下的取代度也不同。Huang等[13]用氯磺酸-吡啶法制备硫酸化黄芪多糖，以氯磺酸∶吡啶配比、反应温度和反应时间为因素水平设计正交试验对黄芪多糖硫酸化修饰条件进行优选，发现最佳条件为氯磺酸∶吡啶体积比为1∶6，反应温度95 ℃，反应时间1 h，各因素对硫酸基取代度的影响程度依次为反应温度>试剂比例>反应时间。Qian等[14]采用氯磺酸-吡啶法对霍山石斛多糖(Dendrobium huoshanense polysaccharides)进行了硫酸化修饰，并以响应面优化法探究出条件为60 ℃，160 min，氯磺酸∶吡啶体积比为1∶2时，霍山石斛多糖硫酸化取代度最好，为1.473。Zhang等[15]以正交试验采用氯磺酸-吡啶法对麦冬多糖进行硫酸化修饰，确定硫酸化最优条件为氯磺酸∶吡啶体积比为1∶4，80 ℃，3 h，硫酸取代度为1.62。张汇等[16]采用氯磺酸-吡啶法对黑灵芝水不溶性多糖进行硫酸化修饰，采用三因素三水平正交试验确定最佳条件为氯磺酸∶吡啶体积比为1∶2，75 ℃，4 h，硫酸取代度为1.30，各因素对硫酸取代度的影响程度为试剂比例>温度>反应时间。本试验采用磺酸-吡啶法对太白蓼多糖进行硫酸化修饰，并用单因素和正交试验确定条件为酯化试剂体积比为1∶10，反应温度为80 ℃，反应时间为1 h，太白蓼多糖硫酸取代度最好，为1.57，各因素对硫酸基取代度的影响程度依次为反应时间>反应温度>试剂比例。

研究发现，多糖的生物活性与多糖的空间结构密切相关，中药多糖经过分子修饰后，其空间结构发生了改变，产生新的构象，其物理化学性质、生物活性随之改变，可以增强或者赋予中药多糖更多的药理活性和减弱其药物毒性[17]。李公斌[18]研究表明，硫酸化黑木耳多糖对金黄色葡糖球菌和大肠杆菌有不同程度的体外抑制作用，抑制时效可达16～20 h。申进文等[19]的研究表明，硫酸化秀珍菇发酵胞外多糖对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌均有较好的抑菌活性。在一定的质量浓度范围内，随着秀珍菇发酵胞外多糖硫酸酯质量浓度的增加(0～25 g/L)，其抑制大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的能力迅速增强，其质量浓度在25 g/L时，对3种细菌的抑制率均达到95%左右。而刘莹等[20]的抗菌活性试验显示，硫酸化和乙酰化后的金针菇多糖衍生物抗菌活性较弱，对供试的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌质量浓度为25～50 g/L。本试验结果表明，硫酸化太白蓼多糖对大肠杆菌和志贺氏菌具有体外抑制作用，与太白蓼多糖相比，硫酸化修饰后其抑菌活性明显增强，究其原因，可能是由于磺酸基团的加入，导致PTKP的疏水性改变，对细菌的细胞膜和细胞壁造成破坏，引起蛋白质的溶解和细菌中的重要分子的渗透，营养物质吸收、ATP活性及核苷酸合成等功能性障碍，最终导致细胞死亡。

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(责任编辑：潘学燕 Responsible editor:PAN Xueyan)

Sulfate Modification ofPolygonumtaipaishaneaseKung Polysaccharide and Antibacterial Activity of Modified Products in Vitro

AN Le,ZHAO Qiuyun,QIN Peixi,WENG Maoyang,CHEN Lei,KE Jinpeng,QING Suzhu and ZHANG Weimin

(College of Veterinary Medicine,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100,China)

To create the condition of sulfated modification ofPolygonumtaipaishaneaseKung polysaccharide (PTKP) and explore the influence of sulfation on antibacterial activity of PTKP,based on index of sulfate substitution degree,PolygonumtaipaishaneaseKung polysaccharide was modified by chlorosulfonic acid pyridine method. The modification conditions were optimized with L9(34) orthogonal experiment by using the ratio of chlorosulfonic acid to pyridine,reaction time and reaction temperature as the factor levels. Barium sulfate - gelatin turbidity method was used to determine the degree of substitution (DS). Then,the structure of modified products were detected by Fourier infrared spectroscopy.The minimum bactericidal concentrations of sulfatedPolygonumtaipaishaneaseKung polysaccharide( sPTKP) onE.coliand Shigellosis were also examined by micro broth dilution method. The best conditions of sulfated modification onPolygonumtaipaishaneaseKung polysaccharide were as followings: the volume ratio of chlorosulfonic acid to pyridine was 1∶10,reaction temperature was 80 ℃,reaction time was 1 h,and the degree of substitution was 1.57. S=O stretching vibration peaks were detected in the infrared spectrum. Both PTKP and sPTKP could inhibitE.coliand Shigellosis in vitro,and their inhibitory effects on Shigella was better than onE.coli.In conclusion,sulfated modification could improve the antibacterial activity ofPolygonumtaipaishaneaseKung in vitro.

PolygonumtaipaishaneaseKung; Sulfated modification; Orthogonal test; Antibacterial activity

AN Le,female,master student.Research area:developmental biology.E-mail:252395140@qq.com

QING Suzhu,female,Ph.D,professor.Research area: basic veterinary science.E-mail: suzhuqing@163.com

2015-12-01

2016-01-27 基金项目： 陕西省科技攻关项目(2013K01-61-01)；陕西省农业财政项目(K332021402)；西北农林科技大学2015年“大学生创新创业训练计划”校重点项目(1201510712041)。

安 乐，女，硕士研究生，研究方向为发育生物学。E-mail：252395140@qq.com

卿素珠，女，博士，教授，研究方向为基础兽医学。E-mail：suzhuqing@163.com 张为民，男，副教授，研究方向为临床兽医学。E-mail：ylzhangwm@163.com

日期：2016-10-20

S859.3

A

1004-1389(2016)10-1541-07

ZHANG Weimin,male,associate professor.Research area:clinical veterinary medicine.E-mail:ylzhangwm@163.com

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161020.1655.038.html

Received 2015-12-01 Returned 2016-01-27

Foundation item Scientific and Technological Project of Shaanxi Province (No. 2014K02-05-01); Agricultural Finance Project of Shaanxi Province (No. K332021402); 2015 Northwest A&F University “Students Innovation and Entrepreneurship Training Program” of School Key Project (No. 1201510712041).