黄芪糖蛋白对胶原诱导性关节炎小鼠Th17/Treg细胞免疫平衡的影响

刘慧 赵俊云 杨向竹 薛慧清 李彩彩 马鑫 张娜 周然



黄芪糖蛋白对胶原诱导性关节炎小鼠Th17/Treg细胞免疫平衡的影响

刘慧 赵俊云 杨向竹 薛慧清 李彩彩 马鑫 张娜 周然

目的 研究16kD黄芪糖蛋白对胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)模型小鼠Th17/Treg细胞免疫平衡的影响，探讨黄芪糖蛋白治疗胶原诱导性关节炎小鼠的免疫作用机理。方法 采用雄性Balb/c小鼠建立牛Ⅱ型胶原诱导性关节炎小鼠模型，将造模成功的小鼠随机分为CIA模型组、氢化可的松阳性对照组、黄芪糖蛋白高、中、低剂量组，另设空白对照组；各治疗组腹腔注射药物14天，对照组与模型组注射等体积生理盐水。采用流式细胞术检测各组小鼠外周血CD3+CD4+IL-17A+Th17细胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例；Western blot法检测各组小鼠脾组织中维甲酸相关孤独受体γt(retinoid-related orphan receptor γt, RORγt)和叉头状转录因子3 (forkhead box protein 3,Foxp3)的蛋白表达水平。结果 流式检测结果显示,黄芪糖蛋白可显著降低模型组小鼠外周血中CD3+CD4+IL-17A+Th17细胞比例(P<0.01)，提高CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的比例(P<0.01)。Western blot结果显示黄芪糖蛋白可显著降低模型组小鼠脾组织中RORγt的表达(P<0.01),提高Foxp3的表达(P<0.01)。结论 黄芪糖蛋白提高Foxp3的表达水平，降低RORγt的表达水平，恢复Th17/Treg细胞之间的平衡，可能是黄芪糖蛋白治疗胶原诱导性关节炎小鼠的机制之一。

黄芪糖蛋白； RORγt； Foxp3； 胶原诱导性关节炎小鼠

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是以多关节滑膜炎、骨及软骨破坏为主要特征的慢性自身免疫性疾病，致残率极高[1]。到目前为止，虽然RA的病因及发病机制尚不明确，但T细胞功能紊乱，尤其是CD4+T细胞异常活化，在RA的发生发展中处于中心环节[2]。黄芪为传统补中益气中药，具有补气升阳、固表止汗等多种功效。本课题组通过水浸提法自膜荚黄芪的干燥根中分离出一种糖蛋白均一组分，即黄芪糖蛋白，进而从黄芪糖蛋白中分离纯化出一种16kD组分，命名为AmRP10-16[3]。笔者团队前期研究发现，黄芪糖蛋白具有一定免疫抑制作用，且可改善佐剂性关节炎大鼠的关节炎症[4-5]。本实验以胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)模型小鼠为研究对象，予16kD AmGP腹腔注射给药，以Th17/Treg细胞平衡为切入点研究16kD黄芪糖蛋白(astragalus membranaceus glycoprotein,AmGP)对CIA小鼠Th17、Treg细胞比例及其特异性转录因子维甲酸相关孤独受体γt(retinoid-related orphan receptor γt, RORγt)和叉头状转录因子3 (forkhead box protein 3,Foxp3)蛋白表达的影响，探讨AmGP治疗CIA的免疫作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

Balb/c雄性小鼠，90只，体质量(18±2)g，清洁级，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK(京)2014-0004。

1.2 主要药物、试剂、仪器

AmGP为自制；弗氏完全佐剂，Sigma公司;胶原蛋白Ⅱ型(牛)，Chondrex公司；Anti-RORγt Purified、Anti-Foxp3 Purified，eBioscience公司；β-actin、HRP标记羊抗兔IgG、HRP标记羊抗小鼠IgG，北京博奥森生物技术有限公司；四甲基乙二胺，北京康为世纪生物科技有限公司；苯甲基磺酰氟、过硫酸铵、Tween-20、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、聚偏氟乙烯微孔转移膜、5%脱脂奶粉、Tris、SDS、BCA蛋白定量试剂盒，Solarbio公司;Mouse IL-17A PE-Cy7 Antibody、Mouse CD4 FITC Antibody、Anti-Mouse CD25 APC、Anti-Mouse Foxp3 PE、Cocktail(PMA+Ionomysin+BFA)，美国BioLegend公司。

JY600C型电泳仪，北京君益东方电泳设备有限公司；酶联免疫检测仪，Tecan公司；流式细胞仪，美国BD公司。

1.3 实验方法

1.3.1 模型制备 Balb/c雄性小鼠80只，适应性喂养一周，参考文献方法[6]，将溶解的CⅡ与等体积CFA在冰浴中充分乳化，以0.1 mL/只在小鼠腹部、背部和尾根部多点皮下注射，进行基础免疫，当天记为第1天，第21天以同样的方法加强免疫。以关节肿胀度评分标准评价模型复制是否成功。

1.3.2 分组及给药 将造模成功的50只小鼠随机分为模型组、氢化可的松(hydrocortisone，HC)阳性对照组、黄芪糖蛋白高、中、低剂量组，每组10只；基础免疫后第42天开始给药治疗：HC组小鼠腹腔注射HC 10 mg/kg；AmGP低、中、高剂量组分别按0.5 mg/kg、1.0 mg/kg、2.0 mg/kg腹腔注射AmGP；正常组、模型组小鼠腹腔注射等体积生理盐水；注射体积均为0.4 mL/20 g，每天一次，共治疗两周。

1.4 指标检测

1.4.1 关节肿胀度评分 采用0～4级关节评分法，关节炎得分计算方法为：0分，脚趾正常或无炎症；1分，脚趾关节肿胀或轻度发红；2分，趾关节和足趾发红并且肿胀；3分，踝关节以下整个足爪发红并且肿胀；4分，踝关节严重发红且肿胀，关节有变形迹象。每隔3天观察并记录小鼠四肢关节病变情况，四肢关节评分累计之和为每只小鼠的多发性关节炎指数(arthritis index，AI)。AI值≥4分表示造模成功。

1.4.2 流式细胞术检测 小鼠外周血Th17、Treg细胞比例第57天各组小鼠摘眼球取血，流式细胞仪检测小鼠外周血Th17、Treg细胞比例，方法完全按照试剂盒说明进行。

1.4.3 Western blot法检测 脾组织中RORγt、Foxp3蛋白的表达第57天处死小鼠，取各组小鼠脾组织，提取总蛋白并采用BCA法定量，取总蛋白40 μg 进行SDS-PAGE蛋白电泳、转膜、杂交。显影结果采用Quantity One软件分析各组条带灰度值，以目标蛋白与内参比值反应脾组织蛋白表达情况。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 CIA小鼠的一般情况

正常组小鼠在整个实验期间饮食正常，活泼，皮毛光泽；模型组小鼠进行免疫注射后可见食欲下降，体重减轻，皮毛黯淡干枯，并出现轻度脱毛现象，关节红肿畸形，跛行。各药物组小鼠关节红肿均有所减轻，精神状态及饮食较模型组均明显改善。

2.2 CIA小鼠AI值

正常组小鼠足爪关节无红肿现象，AI值为0；所有造模小鼠于基础免疫后第22天开始出现关节肿胀、发红等典型改变，并随时间推移逐渐加重，造模小鼠于基础免疫后第42天关节炎指数达到高峰，与对照组比较有统计学意义(P<0.01)。随着各给药组的持续用药，AI值不断降低；其中HC组小鼠关节炎指数最小，与模型组比较AI值降低明显(P<0.01)；AmGP不同剂量组AI值较模型组均有不同程度降低(P<0.01)。结果见图1。

图1 黄芪糖蛋白对CIA小鼠关节炎指数影响的变化趋势

2.3小鼠外周血Th17、Treg细胞比例

与正常组比较，模型组小鼠外周血Th17细胞比例升高，Treg细胞比例降低，差异有统计学意义(P<0.01)。治疗后，与模型组比较，HC组与AmGP各剂量组Th17细胞比例不同程度降低，Treg细胞比例升高，且差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。见表1。

表1 黄芪糖蛋白对CIA小鼠外周血Th17、Treg细胞比例的影响

注： 与正常组比较，aP<0.01;与模型组相比，bP<0.05，cP<0.01。

2.4 小鼠RORγt 、Foxp3蛋白的表达

Western blot检测结果显示，与正常组比较，模型组RORγt表达升高，Foxp3表达降低(P<0.01)；与模型组比较，HC组和AmGP中、高剂量组RORγt表达降低，Foxp3表达升高(P<0.01)。数据见表2，杂交结果如图2。

注：A.正常组;B.模型组;C.HC组;D.AmGP低剂量组;E.AmGP中剂量组;F.AmGP高剂量组

组别nRORγt/β⁃actinFoxp3/β⁃actin正常组100．328±0．0190．525±0．016模型组100．439±0．012a0．325±0．031aHC组100．305±0．069b0．467±0．038bAmGP低剂量组100．421±0．0250．362±0．012AmGP中剂量组100．292±0．088b0．429±0．061bAmGP高剂量组100．341±0．011b0．448±0．027b

注： 与正常组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01。

3 讨论

黄芪作为补气药在临床广泛应用于治疗RA的多种经方。近年研究表明，黄芪的多种有效成分，如黄芪多糖、黄芪总甙及黄芪黄酮等，具有免疫调节等多种药理作用[7]，且用于治疗RA[8-10]。HC属于肾上腺皮质激素，具有抗感染、抑制免疫等药理作用，是临床治疗RA疗效明确的药物，所以本文将其作为阳性对照。本文成功复制小鼠胶原诱导性关节炎模型，以Th17/Treg细胞平衡为切入点，探究AmGP作用于CIA小鼠的可能机制及疗效。

Th17和Treg细胞是CD4+T细胞的两个亚型。初始CD4+T细胞在IL-6和TGF-β的共同作用下，通过激活JAK-STAT3途径，诱导RORγt基因的表达，促进初始CD4+T细胞向Th17细胞分化；而在TGF-β的单独作用下，可通过激活JAK-STAT5信号途径，上调Foxp3的表达，促使初始CD4+T细胞分化为Treg细胞[11]。Th17细胞可产生促炎因子IL-17。现已明确Th17细胞及其特异性细胞因子IL-17在RA等自身免疫性疾病中发挥着重要作用[12]。IL-17的促炎效应可诱导破骨细胞和基质金属蛋白酶的产生，促进滑膜炎症、关节与骨的损伤[13]。CD4+CD25+Treg细胞可特异性表达转录因子Foxp3，通过分泌IL-10和TGF-β等抑炎细胞因子发挥抑制T细胞及抗原提呈细胞的功能，减少促炎因子和抗体的产生发挥免疫抑制作用。研究表明，Treg细胞数量减少、功能降低是RA患者免疫失调的重要原因[14]。由此可知，Th17和Treg细胞具有截然相反的免疫作用，Th17细胞可促进RA等自身免疫病的发生发展，而Treg细胞可减轻前者所导致的自身免疫性炎症反应，从而维持机体的免疫平衡状态，因此Th17/Treg细胞失衡在RA发病中发挥重要作用。

RORγt是Th17细胞的关键转录因子，可特异性地调节Th17细胞的分化及功能。Ivanov II等[15]研究表明，RORγt缺失的动物体内，Th17细胞数量减少，发生自身免疫疾病的概率降低；同时还表明，无论体内外诱导Th17细胞的分化都必须要有转录因子RORγt的参与。Foxp3是Treg细胞的标志分子，对Treg细胞的分化发育成熟及发挥免疫抑制作用方面起关键作用，也是Treg细胞最敏感的标记[16]，它与Th17的特异性转录因子RORγt相互拮抗[17]。RORγt/Foxp3平衡可确定初始CD4+T细胞在受到抗原刺激后向Th17或Treg细胞分化的方向[18]。因此，RORγt/Foxp3平衡可从根本上影响Th17/Treg细胞平衡，影响RA等自身免疫病的发生发展。

临床RA患者外周血表达Foxp3的Treg细胞数量减少[19]，而血清及关节液中IL-17的表达则明显升高[20]。牛倩等[21]研究也发现，RA患者外周血Th17细胞比例明显升高，而Treg细胞比例明显降低，提示RA中存在Th17/Treg细胞偏倚。Th17细胞的促炎作用与Treg细胞的抑炎作用在RA的发展中发挥重要作用，恢复Th17/Treg细胞平衡对治疗RA意义重大。

本文以16kD黄芪糖蛋白腹腔注射治疗CIA小鼠，结果显示，与模型组比较，AmGP各剂量组小鼠皮毛较光整，饮食、活动度、精神状态均有改善，AI值降低(P<0.01)，说明AmGP可在一定程度上改善CIA模型小鼠的关节炎症，抑制病情的发展。本研究结果显示，CIA组小鼠外周血中Th17细胞比例升高，Treg细胞比例下降，与正常组比较差异显著(P<0.01)。同时，CIA组小鼠的脾组织中RORγt表达明显升高，Foxp3表达明显降低，与正常组比较，差异显著(P<0.01)，即外周血中Th17、Treg细胞的比例变化与其特异性转录因子的表达变化呈现相同的趋势。Foxp3表达降低，Treg细胞的发育受到抑制，Treg细胞分泌的抑炎因子减少，免疫抑制作用减弱，同时RORγt表达升高，则促使Th17细胞分化，其分泌促炎因子也相应增多，Th17/Treg细胞平衡向Th17细胞方向偏倚，最终导致关节炎症的发生。CIA小鼠经16kDAmGP治疗后，外周血中Th17细胞比例降低，Treg细胞比例升高，相应的，脾组织中RORγt表达降低，Foxp3表达升高，与模型组比较均有统计学意义(P<0.01)，说明16kDAmGP可通过不同程度促进Treg细胞的分化增殖，抑制Th17细胞的分化增殖，有效地恢复Th17/Treg细胞平衡，使CIA模型小鼠的病情逐渐缓解。

16kD黄芪糖蛋白是本课题组在以往提取的黄芪糖蛋白的基础上进一步分离纯化，得到的分子量更小的天然糖蛋白活性分子。本文表明，16kD黄芪糖蛋白对CIA小鼠的治疗作用可能是通过调节RORγt、Foxp3转录因子的表达水平，进而纠正Th17/Treg细胞平衡而实现的。关于16kD黄芪糖蛋白的其他免疫活性及量效关系的研究及其对RA作用机理的进一步探讨将是下一步的研究方向。

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(本文编辑： 禹佳)

Influences of AmGP on Th17/Treg immune balance in CIA mice

LIUHui,ZHAOJun-yun,YANGXiang-zhu，etal.

SchoolofBasicMedicalScience,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China

YANGXiang-zhu,E-mail:xiangzhuy@126.com

Objective To examine the impacts of 16kD astragalus membranaceus glycoprotein (AmGP) on the balance of Th17/Treg in CIA mice; and to investigate the effects of AmGP on CIA mice and its’ mechanism. Methods Bovine type Ⅱcollagen was used to establish CIA model. Mice were randomly divided into five groups: CIA model group, hydrocortisone(HC) positive control group, AmGP groups with low, medium and high dose. In addition, a normal group was built. The HC and AmGP groups were treated by HC or AmGP with intraperitoneal injection, while normal saline was used in the other groups，and the treatment was lasted for 2 weeks. Flow cytometry was used to detect the proportions of CD3+CD4+IL-17A+Th17 and CD4+CD25+Foxp3+Treg cells in peripheral blood of the mice; The protein expressions of RORγt and Foxp3 were evaluated by western blot in mice spleen. Results It is showed that AmGP could significantly reduce the proportion of CD3+CD4+IL-17A+Th17 in peripheral blood of CIA mice (P<0.01). It could improve the proportion of CD4+CD25+Foxp3+Treg cells (P<0.01). Western blot results indicated that AmGP could significantly decrease the expression of RORγt (P<0.01), while increase the expression of Foxp3 in spleen of CIA mice(P<0.01).Conclusion AmGP recovers the balance of Th17/Treg cells by improving the expressions of Foxp3,and reducing the expression of RORγt. This procedure may be one of the mechanisms for AmGP to cure the CIA mice.

Astragalus membranaceus glycoprotein； RORγt； Foxp3； CIA

国家国际科技合作专项(2013DFA30700)

100029 北京中医药大学基础医学院[刘慧(硕士研究生)、赵俊云、杨向竹、李彩彩(硕士研究生)、马鑫、张娜]；山西中医学院科研中心(薛慧清、周然)

刘慧(1989- )，女，2014级在读硕士研究生。研究方向：16kD黄芪糖蛋白作用于CIA小鼠的免疫作用机理。E-mail：13671081286@163.com

杨向竹(1970- )，女，博士，副教授，硕士生导师。研究方向：中药的现代物质基础。E-mail：xiangzhuy@126.com

R285

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2016.12.004

2016-05-16)