不同类型支原体肺炎外周血TIM和TLR基因表达的变化及其意义①

樊 青 颜 萍 李培杰

(济南市妇幼保健院儿科，济南250001)



不同类型支原体肺炎外周血TIM和TLR基因表达的变化及其意义①

樊 青 颜 萍 李培杰

(济南市妇幼保健院儿科，济南250001)

目的：探讨不同类型支原体肺炎患儿外周血Toll受体2、4和Tim、1、3家族基因的变化及其意义。方法：随机选取自2013年3月～2014年3月在济南市妇幼保健院儿科住院的支原体肺炎患儿共56例，将入选的56例根据X线影像学改变分为两组：表现为沿支气管分布的结节状、点片状密度增高影或伴网格状、条索状间质改变者作为支气管肺炎组(40例)，表现为节段性、大叶性实变者作为节段性肺炎组(16例)。同时，选取性别和年龄与支原体患儿组匹配的健康查体儿童30例作为对照组。收集外周静脉全血。抽提总RNA，采用qRT-PCR检测TLR-2mRNA、TLR-4mRNA和Tim-1mRNA和Tim-3mRNA的相对表达量,比较各组之间TLR-2mRNA、TLR-4mRNA和Tim-1mRNA和Tim-3mRNA的相对表达量的差异。结果：(1)支原体肺炎组及MP-支气管肺炎组外周血细胞中TLR-2mRNA、TLR-4mRNA和Tim-l mRNA相对表达值显著高于健康对照组。(2)MP-节段性肺炎组TLR-2mRNA、TLR-4mRNA和Tim-1mRNA、Tim-3mRNA的相对表达量的显著高于健康对照组。(3)MP-节段性肺炎组Tim-1mRNA和Tim-3mRNA的相对表达量的显著高于MP-支气管肺炎组。结论：不同类型的支原体肺炎患儿外周血TLR-2、TLR-4和Tim-1基因均有过度表达,Tim-1、Tim-3基因在肺部感染重症患儿有过度表达，TLR2、4受体和Tim1、3家族基因参与不同类型的支原体肺炎的感染过程。

肺炎，支原体；支气管肺炎；节段性肺炎；基因表达；qRT-PCR

肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia，MP)感染引起的支原体肺炎是儿童常见的一种社区获得性肺炎，有报道显示国内发病率19.6%～21.9%，流行年度最高可达33.1%[1]，大多数肺炎支原体的临床表现为良性进程，有良好的预后。但近年来发现，很多影像学表现为节段性、大叶性实变者肺炎的患儿临床中毒症状重、病程迁延，可伴有多系统、多器官的损害，直接影响了疾病的预后[2]。

支原体入侵宿主细胞后，征服固有免疫和适应性免疫系统的多种宿主防御机制，建立长期感染，Toll样受体(Toll-like Receptor,TLRs)是新近发现的一种天然免疫模式识别受体，在对病原微生物的识别和跨膜信号转导过程中，Toll样受体作为功能受体，既引起天然免疫又能进一步启动获得性免疫，在机体的抗感染免疫过程中具有重要意义[3]。辅助T细胞在支原体感染的细胞免疫中起主要作用,直接造成了呼吸系统的免疫损伤[4]。Tim基因家族是T细胞亚群依赖的免疫应答中的新的关键性调节因子，其家族成员各自表达于Th1和Th2细胞，调节Th1和Th2细胞介导的免疫应答，参与维持体内Th1/Th2平衡。

本研究针对不同X线影像学表现类型的支原体肺炎，研究其外周血中TLR样受体及Tim家族的变化，对于揭示支原体感染造成的免疫损伤具有重要意义。

1 资料与方法

1.1 资料 支原体肺炎组：病例选自2013年1月至2014年6月在济南市妇幼保健院儿科住院的支原体肺炎患儿共56例，其中男32例，女24例。平均年龄(3.72±0.89)岁，符合《实用儿科学》支原体肺炎诊断标准[5],血清MP-IgM抗体滴度>20 bu/ml(阳性),排除其他细菌、病毒、衣原体感染;肺外并发症诊断排除其他病因所致各系统损害。将入选的56例根据X线影像学改变分为两组：表现为沿支气管分布的结节状、点片状密度增高影或伴网格状、条索状间质改变者作支气管肺炎组(40例)，表现为节段性、大叶性实变者作为节段性肺炎组(16例)。

健康对照组：选取同期体检的30例健康儿童为对照组，男18例，女12例，平均年龄(3.85±1.26)岁，均为我院儿科儿保门诊经健康体检合格的正常儿童、无心、肝、肺、肾等重要脏器疾患，肝、肾功能试验正常，近期无任何感染病史。

1.2 方法

1.2.1 采用一次性抗凝采血管采集外周静脉血4 ml，利用Pure血液总RNA提取试剂盒，于采集后2 h内用Trizol法提取血细胞总RNA，操作严格按照说明书的步骤进行。提取完毕后，用紫外分光光度计检测总RNA浓度和纯度，-80℃保存备用。

1.2.2 采用qRT-PCR法来评估检测患儿外周血中TLR2、4和Tim1、3基因的相对表达量，在这项研究中使用的引物见表1。采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒的总体积为25 L[12.5 μl SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ，1 μl引物(f)，1 μl引物(R)和2 μl cDNA]。混合是在lightcycler480 qRT-PCR系统反应(Roche公司，德国),95℃ 30 s；95℃ 5 s；60℃ 30 s；40周期；95℃ 15 s；60℃ 30 s；95℃ 40 s，用β-actin为内参基因。所有的反应重复3次。最后，利用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

2 结果

2.1 不同类型支原体肺炎的一般特点及实验室检查MP-支气管肺炎组的平均年龄小于MP-节段性肺炎组；MP-节段性肺炎组总的热程和住院时间较MP-支气管肺炎组延长；MP-节段性肺炎组C-反应蛋白、ESR显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)，具体见表2。

2.2MP-肺炎与健康对照组相比，MP-肺炎外周血细胞中，TLR-2mRNA、TLR-4mRNA和Tim-1mRNA的相对表达量显著高于健康对照组(P<0.05),具体见表3。

2.3MP-节段性肺炎组与健康对照组相比，MP-节段性支原体肺炎外周血中，TLR-2mRNA、TLR-4mRNA和Tim-1mRNA、Tim-3mRNA的相对表达量显著高于健康对照组(P<0.05),具体见表4。

表1 TLR-2、TLR-4、Tim-1和Tim-3的mRNA引物序列

Tab.1 mRNA primer sequence of TLR-2,TLR-4,Tim-1 and Tim-3

PrimersPrimersequenceTim1F5'-GAACATAGTCTACTGACGGCCAATAC-3'Tim1R5'-GAACCTCCTTTTTGAAGAAATACTTTT-3'Tim3F5'-TCCAAGGATGCTTACCACCAG-3'Tim3R5'-GCCAATGTGGATATTTGTGTT-3'β-actinF5'-GGCACCACACCTTCTACAATG-3'β-actinR5'-TAGCACAGCCTGGATAGCAAC-3'TLR2F5'-TGATGCTGCCATTCTCATTC-3'TLR2R5'-CGCAGCTCTCAGATTTACCC-3'TLR4F5'-TTGAGCAGGTCTAGGGTGATTGAAC-3'TLR4R5'-ATGCGGACACACACACTTTCAAATA-3'

表2 MP-支气管肺炎与MP-节段性肺炎的临床特点对比

Tab.2 Clinical features comparison of MP-bronchopneu-monia and MP-segmental pneumonia

OutcomemeasuresMP-broncho-pneumonia(n=40)MP-segmentalpneumonia(n=16)tPAge(year)3.3±1.24.6±0.83.980.002Totalfeverprocess(day)4.5±1.56.7±2.24.3160.001HLOS(day)7.5±1.310±1.85.80.001WBC(×109)6.67±0.87.38±1.12.680.0096CRP(mg/L)7.6±2.312.5±2.76.850.001ESR(mm/h)21±3.526±2.25.290.001

表3 MP-肺炎与健康对照组外周血TLR-2、TLR-4和Tim-1、Tim-3的相对表达量的对比

Tab.3 Relative expression comparison of TLR-2,TLR-4,Tim-1 and Tim-3 mRNA levels in peripheral blood of MP-pneumonia group and healthy group

TestindexHealthygroup(n=30)MP-pneumoniagroup(n=56)tPTLR20.03846±0.00360.05122±0.0017273.6120.0005TLR40.01078±0.0018130.01774±0.0016782.4350.0172Tim10.0002334±0.000030470.0004287±0.00001696.0880.0001Tim30.004874±0.00047940.004785±0.00047941.9370.8467

表4 MP-节段性肺炎组与健康对照组外周血TLR-2mRNA、TLR-4mRNA和Tim-1mRNA、Tim-3mRNA的相对表达量的对比

Tab.4 Comparison of TLR-2,TLR-4,Tim-1 and Tim-3 relative mRNA expression levels in peripheral blood of MP-segmental pneumonia group and healthy group

TestindexHealthygroup(n=30)MP-segmentalpneumoniagroup(n=16)tPTLR20.03846±0.00360.05381±0.0036562.7320.009TLR40.01078±0.0018130.01792±0.0021272.4370.0189Tim10.0002334±0.000030470.0005303±0.000032726.1650.0001Tim30.004874±0.00047940.006191±0.000225510.350.0001

表5 MP-支气管肺炎组与健康对照组外周血TLR-2mRNA、TLR-4mRNA和Tim-1mRNA、Tim-3mRNA的相对表达量的对比

Tab.5 Comparison of TLR-2,TLR-4,Tim-1 and Tim-3 relative mRNA expression levels in peripheral blood of MP-bronchopneumonia group and healthy group

TestindexHealthygroup(n=30)MP-bronchopneumoniagroup(n=40)tPTLR20.03846±0.00360.05018±0.0019333.060.0032TLR40.01078±0.0018130.01767±0.0020872.3950.0194Tim10.0002334±0.000030470.000388±0.000015844.8190.0001Tim30.004874±0.00047940.004224±0.00023321.3160.1927

2.4 MP-支气管肺炎组与健康对照组相比，MP-支气管肺炎组外周血中，TLR-2mRNA和Tim-1mRNA的相对表达量显著高于健康对照组(P<0.05),具体见表5。

2.5 MP-支气管肺炎组与MP-节段性肺炎组相比，MP-节段性支原体肺炎外周血中，Tim-1mRNA、Tim-3mRNA的相对表达量显著高于MP-支气管肺炎组(P<0.05),具体见表6。

表6 MP-节段性肺炎组和MP-支气管肺炎组外周血TLR-2mRNA、TLR-4mRNA和Tim-1mRNA、Tim-3mRNA的相对表达量的对比

Tab.6 Comparison of TLR-2,TLR-4,Tim-1 and Tim-3 relative mRNA expression levels in peripheral blood of MP-bronchopneumonia group and MP-segmental pneumonia group

TestindexMP-bronchopneu-moniagroup(n=40)MP-segmentalpneumoniagroup(n=16)tPTLR20.05018±0.0019330.05381±0.0036560.94730.3477TLR40.01767±0.0020870.01792±0.0021270.94410.0700Tim10.000388±0.000015840.0005303±0.000032724.3870.0001Tim30.004224±0.00023320.006191±0.00022554.9590.0001

表7 MP-肺炎患儿基因相对表达量与MP滴度的相关分析

Tab.7 Correlation analysis between relative expression levels of genes and MP titers in MP-pneumonia children

GenetestvalueMPTitersRsPTLR20.12060.007TLR40.014550.3628Tim10.2220.0002Tim30.0349810.1562

2.6 MP-肺炎患儿外周血中，TLR-2mRNA、TLR-4mRNA和Tim-1mRNA、Tim-3mRNA的相对表达量与MP滴度的相关性研究发现，TLR-2mRNA和Tim-1mRNA的相对表达量随着MP感染滴度的增加而增加，结果见表7。

3 讨论

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，MP)是已知的介于细菌和病毒之间的能独立生活的最小病原微生物，它黏附于黏膜上皮细胞上，释放毒性代谢产物，导致纤毛运动减弱、上皮细胞损伤，同时继发体液和细胞免疫反应，进一步损伤肺组织并导致肺外靶器官损伤。

在支原体肺炎病程初期，X线表现为肺纹理的增粗、增多，主要是单核细胞和淋巴细胞的浸润，使得支气管与细支气管发生充血与水肿，若病情未得到控制，淋巴细胞和单核细胞将进一步浸润，其炎性渗出物不止局限于肺间质，并向临近组织蔓延。X线会出现点状、斑状、片状甚至大片状阴影[6]，MP肺炎病变以间质性肺炎多见，肺部病变常累及一肺叶，仅少数成大叶性肺炎改变，而不同影像学表现的支原体肺炎临床表现有很大差别。

由本组资料可见，相对于MP-支气管肺炎组，MP-节段性肺炎组具有热程长、平均住院日长、临床表现严重等特点。目前认为，支原体感染引起肺损伤的机制包括直接侵犯和免疫损伤，前者是病原侵犯、黏附、释放毒素等直接损伤呼吸道黏膜，后者是因为支原体感染后激发细胞介导的免疫反应，造成肺组织和其他靶器官的损伤[7]。支原体感染的免疫损伤过程包括，机体的免疫清除、免疫紊乱，病原体的免疫逃逸，这些免疫机制的异常都会促进重症支原体肺炎的发生[8]。

TLR是一类跨膜受体，因其胞外段结构与一种果蝇蛋白Toll同源而得名，是一个重要的模式识别分子受体。在支原体的免疫清除过程中，通过Toll样受体识别MP膜上的脂蛋白呈递抗原并激活巨噬细胞、中性粒细胞、NK细胞等固有免疫细胞，将其募集到感染部位并清除[9]。巨噬细胞作为TLR的主要表达者，在清除MP时发挥重要作用。巨噬细胞经其表面TLR,主要是TLR2识别MP特异性抗原后，通过MyD88-NF-κB信号传导激活，将入侵的MP吞噬后在其溶酶体内杀灭[10]。

本课题既往研究显示，与健康对照组相比，MP肺炎患儿外周血中TLR-2mRNA、TLR-4mRNA的相对表达量有显著差异，证实了TLR-2、TLR-4受体参与了支原体在机体感染作用。本实验进一步表明MP-节段性肺炎组的支原体滴度与MP-支气管肺炎组相比，有显著性差异，即随着支原体滴度的升高，患儿的肺部炎症更加明显，临床症状更严重。进一步实验表明，MP-肺炎患儿的TLR-2mRNA的定量与患儿MP的滴度成正相关，分析支原体感染时，随着支原体滴度的增加，病情的进一步加重，TLR-2在患儿体内的浓度相应增加，参与机体对支原体病原菌清除，提示TLR-2mRNA的定量与患儿的病情严重性密切相关。

在感染MP的呼吸系统内，T细胞同时扮演了免疫保护和免疫治病的双重角色，Cartner等[11]发现，缺失T或B细胞的SCID小鼠和免疫正常的小鼠感染相同数量的MP后，前者肺部的临床症状明显好于后者，但两者肺部的MP数量，没有不同，提示引起支原体肺炎肺部症状的主要原因不是病原体本身而是淋巴细胞。

Tim-1和Tim-3是近年发现的T 细胞免疫球蛋白域黏蛋白域(T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein，Tim)基因家族中两个主要的成员，Tim-1特异表达于Th2细胞表面，其与配体结合后可协同刺激Th2细胞增殖和细胞因子的分泌，说明Tim-1具有调节Th2细胞介导的免疫应答的功能[12]。Tim-3选择性表达在分化的Th1细胞上，通过与其配体即半乳糖凝集素-9结合,为T细胞提供一种负性共刺激信号，下调Th1的反应[13]。

Th1细胞分泌IFN-γ、IL-2、IL-12、TNF-β等促炎症介质为特征，可增强杀伤炎症细胞的细胞毒性作用，介导细胞免疫应答。Th2细胞可产生IL-4、5、6、10等细胞因子，以抗炎症介质为主，促进抗体的产生，介导体液免疫应答。如果某些因素引起Th1/Th2失衡，则导致免疫功能紊乱，引起疾病的发生。

本课题既往研究显示，与健康对照组相比，所有MP-肺炎患儿外周血中Tim-1mRNA的相对表达量有显著升高，提示Tim-1在支原体感染的急性期发病机制中起一定的作用，Tim-1作为表达在活化后的Th2细胞表面的特征性分子，表达量明显增加,提示Tim-1在支原体感染的急性期，体内细胞免疫Th1细胞应答受到抑制，以Th2优势应答为主。

与健康对照和MP-支气管肺炎两组相比，MP-节段性支原体肺炎组Tim-1mRNA和Tim-3mRNA的相对表达量明显升高，提示在支原体感染造成肺部感染明显、临床症状明显的MP-节段性肺炎组，Tim-1mRNA和Tim-3均有显著性升高，特别是针对支原体感染造成的支气管肺炎组，Tim-3作为Th1型应答的负调节因子，推测可能随着病情的进一步加重，机体的免疫功能紊乱更明显，使得支原体病原菌感染的持续化、慢性化、严重化。综上所述，TLR-2、TLR-4和Tim-1、Tim-3参与了不同类型的MP感染的过程，检测外周血中TLR2、TLR4和Tim1、Tim3的定量有助于判断患儿肺部感染程度和临床病情严重性，对支原体感染的治疗和预后有积极的作用。

[1] 郭章溉,王丽红,曹兰华,等.肺炎患儿支原体感染的调查[J].实用儿科杂志,1993,8(3):34-35.

[2] 丁圣刚,王亚亭,吴 德,等.节段性肺炎支原体肺炎69例[J].实用儿科临床杂志,2008,23(4):283-284.

[3] Medzhitov RT.Toll-like receptors and innate immunity[J].Nat Rev Immunol，2001,1(2):135-145.

[4] Romero-Rojas A,Ponce-Hernández C,Ciprián A,etal.Immunomodulatory properties of mycoplasma pulmonis：characterization of the immunomodulatory activity[J].Int Immunopharmacol,2001,1(9/10):1679-1688.

[5] 胡亚美,江载芳.诸福堂实用儿科学[M].第7版.北京:人民卫生出版社,2003:1204-1205.

[6] 李奎光,雷春香.小儿肺炎支原体肺炎的X线诊断分析[J].中国医学工程,2012,10(7):143,145.[7] Tamura A,Matsubara K,Tanaka T,etal.Methylprednisolone pulse therapy for refractory Mycoplasma pneumoniae pneumonia in children[J].J Infect,2008,57(3):223-228.

[8] 郭 赟.儿童重症肺炎支原体肺炎的免疫机制研究[J].国际儿科学杂志,2012,39(2):199-202.

[9] Shimizu T,Kida Y,Kuwano K.Triacylated lipoproteins derived from mycoplasma pneumoniae activate nuclear factor-kappaB through toll-like receptors 1 and 2[J].Immunology,2007,121(4):473-483.

[10] Lai JF,Zindl CL,Duffy LB,etal.Critical role of macrophages and their activation via MyD88-NFκB signaling in lung innate immunity to Mycoplasma pneumoniae[J].PLoS One,2010,5(12):e14417.

[11] Cartner SC,Lindsey JR,Gibbs-Erwin J,etal.Roles of innate and adaptive immunity in respiratory mycoplasmosis[J].Infect Immun,1998,66(8):3485-3491.

[12] CurlissM L，Gorman JV，Businga TR，etal.Tim-1 regulatesTh2responsesin anairway hypersensitivity model[J].Eur J lmmunol，2012，42：651-661.

[13] ZhuC，Anderson AC，Kuchroo VK.TIM-3 and its regulatoryrole in immuneesponses[J].Curt Top Microbiol Immunol，2011，350:1-15.

[收稿2015-04-05 修回2015-06-01]

(编辑 许四平)

Expression levels of Tim and TLR gene family and its clinical significance in children with different types of mycoplasma pneumonia

FAN Qing,YAN Ping,LI Pei-Jie.Jinan Municipal Maternity and Child Care Hospital,Ji′nan 250001,China

Objective:To explore expression levels of Tim and TLR gene family in children with different types of mycoplasma pneumonia and their clinical significance.Methods: 56 patients with mycoplasma pneumonia were randomly selected in Ji′nan Maternity and Child Care Hospital from March,2013 to March,2014.All the patients were divided into bronchopneumonia group (n=40) and segmental pneumonia group (n=16) according to their X-ray manifestations.Bronchopneumonia group was characterized as dot,nodular increased density shadow with or without reticular,stripe-like interstitial lesion.Segmental pneumonia was described as segmental or lobar consolidation of lung in X-ray.Meanwhile,30 healthy children were involved in control group with matched age and gender.Peripheral venous blood of all the children in every group was collected and total RNA was extracted.The mRNA of Toll-recepter 2，4 and Tim1，3 was quantified by quantitative real-time PCR (qRT-PCR),and compared between different groups.Results: The expression of mRNA of TLR-2，4 and Tim1 significantly increases in both bronchopneumonia group and segmental pneumonia group compared to healthy control.Meanwhile,the mRNA of TLR-2，4 and Tim-1，3 was significantly elevated among segmental pneumonia group compared to healthy control.In addition,the gene expression of Tim1，3 was higher in segmental pneumonia group than bronchopneumonia group.Conclusion: The TLR-2，4 and Tim1 gene are over expressed in both types of mycoplasma pneumonia and Tim-1，3 are highly expressed in children with severe infection in lung.The expression alteration of TLR-2,4 and Tim1,3 gene is involved in different types of mycoplasma pneumonia.

Mycoplasma pneumonia;Bronchopneumonia;Segmental pneumonia；Genie expression;qRT-PCR

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.021

樊 青(1971年-)，女，硕士，副主任医师，主要从事儿科呼吸学研究。

R725.6

A

1000-484X(2016)04-0546-05

①本文为山东省济南市卫生科技发展计划项目(2013-33)。