依那西普对博莱霉素所致小鼠肺纤维化的影响及其机制

陈 忱 贾晓民 赵 杰

(徐州医学院第二附属医院呼吸科，徐州221002)



依那西普对博莱霉素所致小鼠肺纤维化的影响及其机制

陈 忱 贾晓民①赵 杰

(徐州医学院第二附属医院呼吸科，徐州221002)

目的：观察依那西普对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化的作用及可能机制。方法：方法将30只SPF级雄性昆明小鼠随机分为3组，即对照组、模型组、干预组，每组10只。对照组小鼠气管内灌注生理盐水，模型组小鼠气管内灌注博莱霉素5 mg/kg，干预组小鼠气管内灌注博莱霉素后，3 mg/kg依那西普腹腔注射，一周2次。于造模后28 d处死小鼠，收集肺组织，碱水解法检测羟脯氨酸含量；肺组织用4%多聚甲醛固定后，石蜡包埋切片，行HE染色及Masson染色；Western blot法检测肺组织NF-κB和磷酸化NF-κB的表达。结果：干预组小鼠肺组织羟脯氨酸含量较模型组明显下降(P<0.01)；干预组肺组织炎症评分较模型组明显下降(P<0.01)，肺纤维化评分较模型组下降(P<0.01)；干预组肺组织磷酸化NF-κB的表达下降(P<0.01)。结论：依那西普可抑制NF-κB的磷酸化，减轻博莱霉素导致的小鼠肺部炎症程度和纤维化改变，延缓肺纤维化进展。

肺纤维化；博莱霉素；依那西普；肿瘤坏死因子α；NF-κB

肺纤维化(Pulmonary fibrosis，PF)是一种渐进性发展的疾病，目前其发病机制尚不明确，尚无明确有效的治疗措施[1]。肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor α,TNF-α)能促进成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积，促进纤维化的形成，核因子κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)可以参与TNF-α介导的炎症反应和上皮-间质转化过程[2]。本实验用博莱霉素(Bleomycin,BLM)建立小鼠肺纤维化模型，用依那西普(Etanercept,Et)与TNF-α受体结合，探讨依那西普对肺纤维化的干预作用及其对NF-κB的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 8～10周龄SPF级雄性昆明小鼠30只，体重为18～22 g，购自徐州医学院动物中心。

1.2 方法

1.2.1 实验方法 将30只小鼠随机分为3组，即对照组、模型组、干预组，每组10只。小鼠用10%水合氯醛(4 ml/kg)腹腔注射麻醉，固定于操作台上，消毒，沿颈部正中切开，钝性分离至暴露气管，模型组及干预组给予博莱霉素(5 mg/kg)气管内注入，对照组注入等量生理盐水。模型建立后干预组小鼠给予依那西普3 mg/kg溶于生理盐水内腹腔注射，一周2次，对照组及模型组给予等量生理盐水腹腔注射。于造模后第28天腹主动脉放血法处死小鼠，收集肺组织标本待测。

1.2.2 观察指标 ①肺组织羟脯氨酸含量测定：精确称量30 mg肺组织，加入裂解液1 ml混匀，95℃水解20 min，流水冷却后各管加指示剂1滴，加入调pH甲液1 ml，逐滴加入调pH乙液至液体变为黄绿色，加双蒸水至10 ml，加入适量活性炭，3 500 r/min离心10 min，取上清液1 ml作检测；②肺组织病理学表现及肺泡炎和纤维化评分：取小鼠左肺于4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋切片，行HE及Masson染色，参照Szapiel等[3]和Ashcroft等[4]的标准，对肺组织病理切片进行肺泡炎症和纤维化程度进行评分。肺泡炎分为4级：0级：无肺泡炎；1级：轻度肺泡炎，面积小于全肺的20%；2级：中度肺泡炎，受累面积占20%～50%；3级：重度肺泡炎，受累面积大于50%。肺纤维化分级标准：0级：无纤维化；1级：轻度纤维化，受累面积小于全肺20%；2级：中度纤维化，受累面积占20%～50%；3级：重度纤维化，受累面积大于50%，肺泡结构紊乱。分别以0、1、2、3分代表0～3级评分。③Western blot法检测肺组织NF-κB的表达：肺组织匀浆后提取总蛋白，测定蛋白浓度，进行SDS-PAGE电泳、转膜，封闭液室温封闭2 h。加入抗磷酸化NF-κB和NF-κB抗体，4℃孵育过夜，Washing Buffer洗膜3次，每次10 min；加入HRP标记的二抗室温孵育2 h，Washing Buffer洗膜3次，每次10 min。将洗好的PVDF膜放入DCIP/NBT显色液中避光显色，应用Image-J软件进行图像分析处理。

1.2.3 药物与材料 盐酸博莱霉素(15 mg/支，日本化药株式会社)。依那西普(25 mg/支，美国恩利公司)。Masson三色染色试剂盒、羟脯氨酸检测试剂盒(南京建成生物工程有限公司)。NF-κB和P-NF-κB抗体、β-actin山羊抗鼠单克隆抗体(美国Bioworld公司)。

2 结果

2.1 小鼠肺组织羟脯氨酸含量 模型组小鼠肺组织羟脯氨酸的含量最高，为(125.61±5.65)μg/mg，对照组最低，为(34.96±2.88)μg/mg，干预组为(66.26±3.24)μg/mg。干预组羟脯氨酸含量明显低于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)；模型组含量高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2 小鼠肺组织病理学表现及肺泡炎和纤维化评分HE和Masson染色观察：第28天时，对照组小鼠肺组织外观大致正常，镜下见肺组织肺泡结构完整，未见明显炎症细胞浸润和胶原纤维沉积；模型组可见肺组织结构紊乱，肺泡内可见炎症细胞浸润，成纤维细胞大量增生，肺泡间隔增厚，肺组织内可见斑片状蓝色胶原纤维沉积；干预组肺组织结构尚完整，部分肺泡腔变形，肺泡间隔有所增厚，肺纤维化程度明显好转，未见片状胶原纤维沉积，见图1和图2。

干预组小鼠炎症和纤维化评分较模型组明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)，模型组明显高于对照组(P<0.01)，差异均有统计学意义，见表1。

2.3 依那西普对NF-κB和P-NF-κB蛋白表达变化 模型组小鼠肺组织内P-NF-κB蛋白表达明显高于对照组(P<0.01)，经依那西普干预后，P-NF-κB的水平较模型组明显降低(P<0.01)，见图3。

图1 各组小鼠肺组织HE染色(×400)Fig.1 HE staining of lung tissue in mice(×400)Note: A.Control group;B.Model group;C.Intervention group.

图2 各组小鼠肺组织Masson染色(×400)Fig.2 Masson staining of lung tissue in mice(×400)Note: A.Control group;B.Model group;C.Intervention group.

GroupInflammationscoreFibrosisscoreControlgroup00Modelgroup2.50±0.321)2.82±0.151)Interventiongroup1.36±0.191)2)1.25±0.131)2)

Note：Compared with control group,1)P<0.01；compared with model group,2)P<0.01.

图3 Western blot检测各组P-NF-κB的表达Fig.3 Expression of P-NF-κB in each group by Weste-rn blot

3 讨论

肺纤维化病死率高，预后差，缺乏有效的治疗措施，早期诊断和治疗是阻断疾病进展的关键。TNF-α为促炎细胞因子，参与炎症反应的急性期，激活内皮细胞黏附，刺激成纤维细胞增殖，导致不可逆转的组织损伤，在组织重构中发挥作用[5]。研究表明，博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化，TNF-α表达明显升高，诱导其他细胞因子的分泌，如IL-1、IL-2、IL-6、TGF-β等，导致肺纤维化形成[6]。TNF-α可以促进纤维母细胞的增殖分化，通过TGF-β诱导的途径促进胶原生成，触发肺纤维化的产生[7]。本实验应用依那西普竞争性阻断TNF-α与其受体结合，发现干预组小鼠肺组织内代表胶原纤维代谢产物的羟脯氨酸含量明显降低，病理组织切片观察发现，与博莱霉素组相比，依那西普使小鼠肺部炎症程度和纤维化改变明显减轻，胶原沉积显著减少，提示依那西普能抑制博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化。

NF-κB是一个重要的转录因子，可以调节许多炎症细胞因子的表达，与炎症性疾病的病理过程有密切关系。研究表明，TNF-α可以促进NF-κB的活化，同时受NF-κB的调控，导致炎症性细胞因子生成增加，从而引起病理性的损伤[8]。博莱霉素诱导的肺纤维化，肺组织的NF-κB表达增加，也可引起TNF-α mRNA表达升高，经NF-κB反义寡核苷酸干预后，可以减低NF-κB的活性，从而减轻炎症反应引起的组织损伤和纤维化程度[9]。据此推测，NF-κB的活化及其导致的细胞因子网络的失衡，可能在肺纤维化动物模型的早期肺损伤过程中起关键作用，抑制NF-κB的活化，或许可以减轻博菜霉素导致的急性肺损伤，延缓肺纤维化的进程。本实验结果证实，博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化，NF-κB蛋白磷酸化激活，经依那西普干预后P-NF-κB蛋白表达明显下降，抑制NF-κB的产生和激活，因此，推测依那西普延缓肺纤维化过程与抑制NF-κB信号转导通路有关。

依那西普可以减轻博莱霉素导致的小鼠肺出血、肺泡炎症程度、肺泡萎缩和肺间质胶原沉积等病理过程，抑制并延缓肺纤维化的进展。其机制可能与抑制NF-κB磷酸化，从而减轻炎症反应，抑制成纤维细胞增生有关。

[1] Raghu G,Collard HR,Egan JJ,etal.An official ATS/ERS/JRS/ALAT statement:idiopathic pulmonary fibrosis:evidence-based guidelines for diagnosis and management[J].Am J Respir Crit Care Med,2011,183(6):788-824.

[2] 卫张蕊，周国锋，田 琼.炎症细胞和细胞因子在肺纤维化中作用的研究进展[J].细胞与分子免疫学杂志,2005,21(Suppl):S85-S87.

[3] Szapiel SV,Elson NA,Fulmer JD,etal.Bleomycin-induced interstitial pulmonary disease in the nude,athymic mouse[J].Am J Rev Respir Dis,1979,120(4):893-899.

[4] Ashcroft T,Simpson JM,Timbrell V,etal.Simple method of estimating severity of pulmonary fibrosis on a numerical scale[J].J Clin pathol,1988,41(4):467-470.

[5] Oikonomou N,Harokopos V,Zalevsky J,etal.Soluble TNF mediates the transition from pulmonary inflammation to fibrosis[J].PLoS One,2006,1(1):e108.

[6] Kuroki M,Noguchi Y,Shimono M,etal.Repression of bleomycin-induced pneumopathy TNF[J].J Immunol,2003,170(1):567-574.

[7] 张 晓，林 莉，张光峰.肿瘤坏死因子及转化生长因子在肺间质病变发病机制中的作用[J].中华风湿病学杂志,2010,14(1):13-16.

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[9] Inayama M,Nishioka Y,Azuma M,etal.A novel IkappaB kinase-beta inhibitor ameliorastes bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice[J].Am J Respir Crit Care Med,2006,173(9):1016-1022.

[收稿2015-07-25 修回2015-08-21]

(编辑 许四平)

Effect and mechanism of etanercept on pulmonary fibrosis in mice induced by bleomycin

CHEN Chen,JIA Xiao-Min,ZHAO Jie.Department of Respiratory Disease，the Second Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Xuzhou 221002,China

Objective:To observe the effect of etanercept on bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice and its possible mechanisms.Methods: Thirty male SPF Kun ming mice were randomly assigned to control group(intratracheal saline injection)or model group(intratracheal injection of bleomycin 5 mg/kg)or intervention group(intratracheal bleomycin injection followed by etanercept 3 mg/kg intraperitoneal administration twice a week)(n=10 group).Lung tissue were taken after the sacrifice of the mice with 28 days of molding.The content of hydroxyproline of the right lung samples was measured by alkaline hydrolysis method,while the left lungs were fixed in 4% paraformaldehyde and embedded in paraffin with the sections stained with hematoxylin-eosin or Masson′s trichrome for pathological examination．Total tissue protein was extracted from lung homogenates to detect the expression of NF-κB and phosphorylation of NF-κB(P-NF-κB) by Western blot.Results: The content of hydroxyproline in lung tissue of mice of intervention arm was decreased significantly compared with the model arm(P<0.01).The alveolar structure of the intervention arm maintained integrity with alveolar septum slightly thickened.The inflammation and fibrosis scores were decreased significantly with noticeable greater improvement of pulmonary fibrosis than the model arm(P<0.01).In addition,the protein phosphorylation of NF-κB in the lung tissues was remarkably decreased in the intervention arm(P<0.01).Conclusion: Etanercept can inhibit the phosphorylation of NF-κB and reduce lung inflammation and fibrosis caused by bleomycin in mice,which may be useful in the treatment of pulmonary fibrosis.

Pulmonary fibrosis;Bleomycin；Etanercept;Tumor necrosis factor-α;NF-κB

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.007

陈 忱(1989年-)，女，硕士，主要从事肺间质方面研究，E-mail:354016903@qq.com。

R563.1

A

1000-484X(2016)04-0483-03

①通讯作者，E-mail:18305206090@163.com。