清络通痹方调控miRNA网络干预类风湿关节炎的研究①

朱亚梅 周玲玲 彭孝武 耿 姗 周学平

(南京中医药大学，南京210023)



·中医中药与免疫·

清络通痹方调控miRNA网络干预类风湿关节炎的研究①

朱亚梅 周玲玲 彭孝武 耿 姗 周学平②

(南京中医药大学，南京210023)

目的：观察清络通痹方(QLT)对胶原性关节炎(CIA)小鼠miRNA网络的调控作用，探讨其干预类风湿关节炎的机制。方法：DBA/1小鼠，复制CIA模型，随机分为空白对照、CIA、QLT组，采用miRCURYTM LNA Array芯片技术筛选外周血miRNA异常表达谱，以Realtime PCR对异常变化的miRNAs进行验证，并利用多种生物信息学软件进行分析。结果：与空白对照组比较，CIA小鼠具有差异表达的miRNAs有221个；与CIA比较，QLT差异表达的miRNAs有169个。RT-PCR验证结果与芯片检测所示具有较好的一致性。PCR结果显示CIA中miR-143下调明显，而QLT干预可明显上调miR-143的表达水平。miR-143靶基因显著富集在VEGF、T细胞受体、MAPK信号通路等信号通路中。结论：多种miRNA的异常表达参与CIA的病理过程，QLT可能通过干预miRNA调控网络，多环节、多途径干预RA免疫、炎症、疼痛等多种病理过程，miR-143可能作为QLT治疗RA的重要环节。

miRNA；胶原性关节炎；清络通痹方

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种临床常见的风湿免疫性疾病，主要表现为自身免疫的紊乱，进而引起滑膜炎和骨质破坏。微小 RNAs(microRNAs,miRNAs)作为一类内源性、短链非编码RNA主要功能是调节蛋白编码基因的表达，越来越多的研究揭示miRNA调控网络在自身免疫性疾病的发病机理中扮演着十分重要的角色[1]，并且大量研究发现在RA关节滑膜组织以及滑液成纤维细胞中miR-155、miR-146a、miR-203等多种miRNA 的表达失调。清络通痹方(Qingluo Tongbi Compound,QLT)由生地黄、青风藤、三七、炙僵蚕、雷公藤组成，为国医大师周仲瑛教授临床应用几十年的经验方，针对RA临床常见的“阴虚络热证”，具有养阴清热、祛风除湿、活血祛瘀、化痰散结的作用。前期研究提示QLT可通过抑制细胞因子网络紊乱、调控多条信号通路抑制RA免疫功能的紊乱和滑膜炎症[2，3]，从多环节、多途径干预RA。单个miRNA可调控生物体内多个基因的表达，而QLT亦具有类似的多靶点调控的特点，因此我们推测QLT能通过调节miRNA的表达干预RA病理过程。本研究将应用高通量miRNA表达谱芯片分析胶原性关节炎(Collagen-induced arthritis，CIA)模型组和QLT给药组miRNA的差异表达，并通过数据整合和应用系统生物学分析方法进一步挖掘数据中的生物学功能信息，为进一步认识QLT干预RA机制提供新的线索。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂 清络通痹方水提液由江苏省植物药研究与新药开发中心提供，清络通痹方水提液含生药1.29 g/ml，使用前蒸馏水稀释。

不完全弗氏佐剂(Incomplete Freund′s adjuvant,IFA，美国Sigma公司,批号12401);完全弗氏佐剂(Complete Freund′s adjuvant,CFA，美国sigma公司,批号12441)；牛Ⅱ型胶原(type II collagen,CⅡ，美国Chondrex公司，批号130217)；Trizol试剂(美国Life Technologies公司，批号79403)；miRCURYTM Array Power Labeling kit(丹麦Exiqon公司,批号208032-A)； miRCURYTM Array,Wash buffer kit(丹麦Exiqon公司,批号208021)。

1.1.2 仪器 荧光定量PCR(罗氏公司 型号：Lishtcycler96)；紫外分光光度计(USA Thermo公司 型号：ND-1000)；Axon GenePix 4000B 扫描仪(Axon Instruments,Foster City,CA)；GenePix Pro 6.0 软件(Axon,CA)。

1.1.3 动物 DBA/1小鼠，雄性，6～8周，9只，常州卡文斯动物公司提供[SCXK(苏)2011-0003]，试验在南京中医药大学实验动物中心内完成，室温(23±3)℃，湿度40%～70 %。动物给予全价颗粒饲料(江苏协同医药生物有限公司供给)喂养，自由饮水，每日光照/黑暗各12 h。动物适应性饲养3 d后进行试验。

1.2 方法

1.2.1 CIA小鼠的制备[4]将牛CⅡ溶于0.01 mol/L的醋酸中，配制成2 g/L溶液，4℃震荡过夜，将溶解的CⅡ与CFA以1∶1比例混，并充分乳化(在冰上操作)。在DBA/1 小鼠尾根靠后处皮内注射100 μl CⅡ与CFA 的混合乳剂进行初次免疫，当天记为d1。到d21用CⅡ与IFA等比混匀，尾根部注射100 μl进行加强免疫。

1.2.2 分组及给药 随机分为3组，每组3只:空白对照组(Normal)不予任何处理，其余组复制CIA模型，分为CIA组，清络通痹方组(QLT)8.7 g/kg，空白对照组和CIA组给予等体积生理盐水，QLT 组d21起每日灌胃给药1次，给药4周后，眼眶取血，-80℃冰箱保存。

1.2.3 总RNA抽提 将处理好的样本中加入Trizol混合按Trizol 说明抽提总RNA，并测定RNA浓度和纯度。

1.2.4 MiRNA芯片分析 采用miRCURYTM Array Power Labeling kit标记，然后应用miRCURYTMLNA Array(v.18.0)进行芯片杂交。杂交后芯片用Wash buffer kit进行洗片，具体步骤按各试剂盒说明书进行。采用Axon GenePix 4000B扫描仪对杂交后芯片进行扫描,使用GenePix Pro6.0软件对扫描图像所得原始数据分析，通过原始值减去背景值来做修正，并用中值做标准化芯片上每个探针的绿色信号强度经过去背景化后，并将4个重复探针取平均值，用中位数标准化的方法对数据进行标准化处理，组间信号值进行比较，比值>1.5为表达上调，<0.5为表达下调。

1.2.5 real-time PCR 采用Primer 5.0设计引物，引物序列见表1，按照试剂盒指定操作步骤扩增，进行real-time PCR反应，PCR程序为：95℃，10 min；40个PCR循环[95℃，10 s；60℃，60 s(收集荧光)]。扩增反应结束后，按 (95℃，10 s；60℃，60 s；95℃，15 s)；并从60℃缓慢加热到99℃(仪器自动进行-Ramp Rate为0.05℃/s)建立PCR产物的熔解曲线。获得扩增曲线及CT值。各样品的目的miRNA和内参(mmu-miR-425-5p)分别进行realtime PCR反应。采用mmu-miR-425-5p作为实验的内参基因进行归一化，数据采用2-△△ CT法进行分析，设置 3 个平行复孔，检测结果取平均值。

表1 实时定量RT-PCR引物

Tab.1 List of primers used in Real time PCR

miRNAPrimersequencemmu-miR-425-5pGSP:5'GGGGAATGACACGATCACTC3'R:5'GTGCGTGTCGTGGAGTCG3'mmu-miR-183-5pGSP:5'GGGTATGGCACTGGTAGAA3'R:5'TGCGTGTCGTGGAGTC3'mmu-miR-203-3pGSP:5'GGGGTGAAATGTTTAGGA3'R:5'TGCGTGTCGTGGAGTC3'mmu-miR-122-5pGSP:5'GGGTGGAGTGTGACAATGG3'R:5'GTGCGTGTCGTGGAGTCG3'mmu-miR-143-3pGSP:5'GGGATGAGATGAAGCACT3'R:5'TGCGTGTCGTGGAGTC3'

Note：GSP.Corresponding to the specific primers of micrornas；R.The primers match the RT primers.

1.2.6 生物信息学分析 应用miRanda、Target-Scan、miRRDB、miRWalk、RNA22靶基因预测网站预测靶基因，取三者交集的靶基因以最大程度的降低预测假阳性率，利用Cytoscape中的插件BINGO对 mmu-miR-143 预测靶基因集合进行功能注释(Gene Ontology ，GO)富集分析，并采用 DAVID 数据库，对预测靶基因集合进行基于KEGG数据库的生物通路富集分析。

2 结果

2.1RNA提取结果 各RNA样本的A260/A280比值均在1.6～1.9之间，提示各样本中总RNA纯度良好，符合miRNA芯片的质量要求，保证了下一步实验的顺利进行。

2.2miRNA芯片筛选结果miRNA芯片提示：与正常对照组小鼠比较，CIA组小鼠具有差异表达的miRNA有221个，其中115个miRNAs表达上调(↑)，106个miRNAs表达下调(↓)；与CIA组比较，QLT组差异表达的miRNA有169个，93个miRNAs表达上调(↑)，76个miRNAs表达下调(↓)。CIA/Normal与QLT/CIA具有反向作用的miRNA共49个，QLT干预可上调其表达水平的miRNA有36个，其中20个miRNAs变化明显(CIA/Normal下调变化倍数<0.5，QLT/CIA上调变化倍数>1.5倍)，见表2；QLT干预可下调其表达水平的miRNA有13个，其中6个miRNAs变化明显(CIA/Normal上调>1.5倍，QLT/CIA下调变化倍数<0.5)，见表3。

2.3real-timePCR芯片结果验证 为检测芯片结果的真实可靠性从芯片结果中选取4个差异表达的miRNA进行real-timePCR，对芯片结果进行初步验证，结果显示CIA组与空白对照组相比，mmu-miR-183-5p、mmu-miR-203-3p、mmu-miR-143-3p、mmu-miR-122-5p变化倍数CIA/Normal<0.5倍，表达均上调(图1A)，QLT/CIA变化倍数>1.5倍，清络通痹方干预均可下调其表达(图1B)，结果显示，所选miRNA在芯片结果中的表达均与RT-PCR变化倍数表达情况一致，如图1，说明本研究的芯片结果基本真实可靠。

PCR结果显示：空白对照组miR-143相对表达量为1.52±0.44，CIA组中miR-143相对表达量为0.59±0.23，与空白对照组相比CIA组miR-143下调明显，差异具有统计学意义(P<0.05)；QLT组其相对表达量为1.08±0.08，与CIA组相比miR-143表达水平上调，差异显著(P<0.05)，如图2。

表2 清络通痹方具有上调干预作用miRNA的变化倍数

Tab.2 Fold changes of miRNAs up-regulated by QLT

miRNAFoldchange(CIA/Normal)Foldchange(QLT/CIA)mmu-miR-29a-5p0.469507014↓1.699634138↑mmu-miR-181a-5p0.402391583↓2.093295151↑mmu-miR-27a-3p0.450875355↓1.588985215↑mmu-miR-183-5p0.428255255↓1.900674813↑mmu-miR-20b-5p0.495110635↓2.096817098↑mmu-miR-33-5p0.420156433↓2.024470612↑mmu-miR-194-5p0.306229664↓2.327504931↑mmu-miR-203-3p0.305148223↓1.801923623↑mmu-miR-199a/199b-3p0.344007709↓2.240078583↑mmu-miR-335-5p0.199094743↓2.907107386↑mmu-miR-19a-3p0.415888524↓1.914543554↑mmu-miR-32-5p0.31344649↓2.239427598↑mmu-miR-101a/c-3p0.413383695↓3.109887676↑mmu-miR-195a-5p0.419610889↓1.978721831↑mmu-miR-122-5p0.194012485↓2.238766954↑mmu-miR-344i0.228540999↓2.055180739↑mmu-miR-215-5p0.380389709↓2.484540029↑mmu-miR-544-5p0.446442457↓1.731614896↑mmu-miR-301a-3p0.437327066↓1.919305201↑mmu-miR-143-3p0.451400018↓2.507247079↑

Note：↑.Fold change>1.5，up-regulated expression；↓.Fold change<0.5，down-regulated expression.

表3 清络通痹方具有下调干预作用miRNA的变化倍数

Tab.3 Fold changes of miRNAs down-regulated by QLT

miRNAFoldchange(CIA/Normal)Foldchange(QLT/CIA)mmu-miR-295-5p1.791609005↑0.23593644↓mmu-miR-449a-3p2.628849627↑0.186170898↓mmu-miR-679-5p2.671667893↑0.426010122↓mcmv-miR-m01-12.106437656↑0.29378167↓mmu-miR-3109-5p2.910775869↑0.398391097↓mmu-miR-493-5p1.851070637↑0.346558879↓

Note：↑.Fold change>1.5，up-regulated expression；↓.Fold change<0.5，down-regulated expression.

图1 RT-PCR与miRNA芯片结果比较Fig.1 Comparison of miRNA fold-changes by miRNA microarray and real-time PCR

图2 QLT对miR-143相对表达水平的影响Fig.2 Effects of QLT on the expression of miR-143 by real time PCRNote: *.P<0.05 vs normal;#.P<0.05 vs CIA.

图3 miR-143潜在作用靶标GO生物学过程富集分析Fig.3 Gene Ontology enrichment analysis of target genes of miR-143

2.4 mmu-miR-143生物信息学方法分析

2.4.1 mmu-miR-143的靶基因预测 利用软件对所有靶基因分析，获得microRNA-基因调控网络，应用miRanda、TargetScan、miRRDB、miRWalk、RNA22预测 mmu-miR-143 的靶基因，取其三者交集的靶基因有1305个，其中结合文献已证实的 mmu-miR-143靶标有：FNDC3B、 MAPK7、 MAPK3、KRAS、COX2、COL1A1、MMP-2、MMP-13、IL13、IL3ra1、Casp3、TNF、Akt1等118个。

2.4.2 mmu-miR-143预测靶基因的功能注释GO分析 根据预测靶基因集合进行GO富集分析，发现有多个GO被miR-143调节，mmu-miR-143靶基因主要参与了离子转运、蛋白质氨基酸磷酸化、骨骼系统发育、核糖核苷酸结合、ATP结合、细胞凋亡等生物过程(P<0.01)，如图3。

2.4.3 mmu-miR-143预测靶基因信号转导通路的富集分析 根据预测出的靶基因集合，采用DAVID数据库对其进行基于 KEGG 数据库的生物通路富集分析，发现mmu-miR-143参与了多个Pathway的调节，其靶基因显著富集在血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、T细胞受体(T cell receptor)、丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase ,MAPK)、神经营养因子(Neurotrophin)、肿瘤等信号通路中(P<0.01)，如图4。

图4 miR-143潜在作用靶标信号转导通路的富集分析Fig.4 KEGG enrichment analysis of target genes of miR-143

3 讨论

RA 是一种以关节滑膜组织慢性炎症为特点的自身免疫性疾病，发病原因迄今尚不明确，其发生可能与遗传、慢性炎症、自身免疫功能紊乱等因素有关，miRNA的发现为RA的研究带来了新的契机。MiRNA与靶基因结合后可介导 mRNA 降解或者抑制其翻译，一个miRNA可调控生物体内多条基因的表达，进而参与细胞发育、分化、增殖、凋亡等生物学过程[5]。多种miRNA(如miR-23b、miR-146a、miR-155、miR-223、miR-203等)通过影响多种前炎症因子的生成[6,7]，干预MAPK等信号分子的表达[6-8]，影响滑膜成纤维细胞增殖、迁移和破骨细胞分化与骨吸收过程[9]，miRNA调控网络对RA的发展起着至关重要的作用[1]。本研究结果显示：与空白对照小鼠比较，CIA小鼠具有差异表达的microRNA有221个，提示多种miRNA的异常表达参与CIA的病理过程。

miRNA芯片结果提示与CIA组比较QLT组差异表达的microRNA有169个，QLT可能有干预作用的有49个miRNAs。其中多种miRNA功能涉及生物体免疫、炎症，细胞周期调控、细胞凋亡及分化等生理病理过程，亦可能参与RA的发展。如Stanczyk等[10,11]证实miRNA-203、miR-19a/b可通过核转录因子κB、调节Toll样受体通路影响基质金属蛋白酶(Matrix Metallo Preteinases，MMP)-1、MMP-3和IL-6的产生，miR-181调节T细胞的发育和成熟，影响单核细胞和巨噬细胞的炎症反应等[12]，在RA滑膜炎症发生和关节破坏方面发挥了重要作用。因此，QLT可能通过干预多种miRNA调控miRNA网络，多环节、多途径干预CIA的多种病理过程。

根据miRNA芯片结果结合文献查阅，miR-143在肿瘤方面的研究显示其可调控MMP-13、MMP-2、MMP-9等细胞因子[13，14]，Toll样受体、MAPK/COX2 等信号分子[15,16]，进而影响细胞的增殖、迁移、侵袭和血管生成等过程。而在RA中多种细胞释放IL、MMPs等细胞因子，并与VEGF、MAPK等多种信号蛋白交互作用，促进滑膜炎、血管翳与骨破坏的发生[17,18]。此外Tam等[19]发现 miR-143在伤害性感受刺激传入的主要神经元上高表达，且CFA 炎性疼痛能够引起 miR-143表达显著下调，提示其可能与炎性疼痛相关。结合结果及文献首先集中对miR-143进行验证及分析，PCR结果显示：CIA中miR-143下调为明显，而QLT干预可上调miR-143的表达水平，提示miR-143可能是清络通痹方调控 miRNA网络的重要靶位之一。生物信息学分析发现miR-143 的靶基因中有VEGF、MAPKs、MMPs、TNF等，并参与了骨骼系统发育、蛋白质氨基酸磷酸化、离子转运结合、细胞凋亡等生物过程；信号通路显著富集在VEGF、T细胞受体、MAPK、神经营养因子信号通路等，均可能与RA炎症、免疫、骨破坏等病理过程密切相关。QLT可能通过干预miR-143影响RA的免疫、炎症、疼痛等多种病理过程。因此，miR-143可能作为复方治疗RA的重要起始或中心环节，与多种细胞因子和信号蛋白相关，且具有网络性调控的特点，因此可作为QLT复方机制研究的切入点。

综上所述，多种miRNA的异常表达参与CIA的病理过程，QLT可能通过干预miRNA调控网络，多环节、多途径干预关节炎免疫、炎症、疼痛等多种病理过程，miR-143可能作为QLT治疗RA的重要环节。本研究为进一步认识QLT干预胶原性关节炎机制提供新的线索，有助于深化对RA病理机制、治疗策略的认识。

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[收稿2015-07-24]

(编辑 许四平)

Study of Qingluo Tongbi Compound treating rheumatoid arthritis based on miRNA network

ZHU Ya-Mei，ZHOU Ling-Ling，PENG Xiao-Wu，GENG Shan，ZHOU Xue-Ping.Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China

Objective:To study the mechanism of Qingluo Tongbi Compound(QLT) treating rheumatoid arthritis(RA)by observing miRNA Network of QLT on collagen-induced arthritis(CIA) mice.Methods: The model of RA was induced by collagenⅡ in DBA/1 mice and randomly divided into control group,CIA group,QLT group.Differently expressed miRNAs were detected by miRCURYTM LNA Array.Real-time PCR was applied to verify the reliability of miRNA array.Results: The bioinformatics software and database were applied to predict and analyze target genes.MiRNA array results showed that 221 miRNAs changed in CIA group compared with the control group,and 169 miRNAs changed in QLT group compared with CIA group.And the results of real-time PCR were consistent with the array.Compared with the control group,miR-143 was significantly reduced in CIA group,intervention of QLT obviously upregulated the expression of miR-143.The target genes of miR-143 were significantly stored in VEGF,T cell receptor,MAPK,signaling pathway.Conclusion: Multiple abnormal expression of miRNAs involved in the pathological process of CIA.QLT affected the expression of various miRNAs,which might be related to immunity,inflammation,pain pathological process of RA and miR-143 could be a potential target in the treatment.

microRNA;CIA;Qingluo Tongbi Compound(QLT)

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.010

①本文受国家自然基金项目(81573869)、2014江苏省普通高校研究生科研创新计划(SJZZ-0122)资助和南京中医药大学国自然预研基金项目(14XYY01、14XYY10)。

朱亚梅(1989年-)，女，在读博士，主要从事中医内科学(风湿病)研究，E-mail: zym-1220@163.com。

R285.5

A

1000-484X(2016)04-0495-05

②通讯作者，E-mail：zxp@njutcm.edu.cn。