microRNA在法医学中的研究进展

董智杰综述，吴 岳审校

(青海大学医学院)



microRNA在法医学中的研究进展

董智杰综述，吴 岳审校

(青海大学医学院)

miRNAs是一类由22个左右核苷酸组成的单链内源性非编码小RNA分子，参与转录后基因表达的调控作用，广泛存在于动植物和病毒中，其表达具有高度的组织特异性和阶段特异性[1-2]。自miRNA于1993年被首次发现以来[3]，人们发现，miRNA不仅参与脂质代谢[4]、细胞的发育及干细胞的维持等众多生理过程[5]，还参与肿瘤[6]、糖尿病[7]、心血管疾病[8]等病理过程。随着对miRNA研究的逐渐深入，miRNA的应用逐渐拓展到法医学领域。本文将从体液来源鉴定、死亡时间推断、死亡原因分析、损伤时间推断、精神疾病的鉴定及年龄推断等方面对miRNA在法医学中的应用现状及可能存在的应用空间进行综述，以期为今后miRNA在法医学中的应用提供帮助。

1 体液来源鉴定

对案发现场遗留的体液进行准确的鉴定对案发现场的重建、案发过程的推断及证据链的完善具有重要意义。法医体液鉴定方法包括传统的免疫学法或生化检测分析法，但这些方法存在特异性低、需要检材量大、不适合腐败检材等缺点[9]。之后，有学者提出用灵敏度高的光谱法进行体液鉴定，但此方法不能区分非人类检材并会破坏检材的DNA[9]。近年来，具有组织特异性的mRNA被用来替代传统方法进行体液鉴定，但mRNA易受温度、湿度及内外源RNA酶等因素的影响而发生降解，因此同样不适合对腐败检材检测[10]。miRNA的表达具有组织特异性，且其片段小，稳定不易降解，不受温度、死因、年龄等的影响，适合腐败检材，因此miRNA比mRNA更适合作法医体液鉴定[11]。

Hanson等[12]于2009年首次应用miRNA进行法医相关体液鉴定，从452个人类miRNA中筛选出9个分别在外周血、精液、唾液、阴道分泌物、经血中特异性表达的miRNA(见表1)，其灵敏度达到50 pg总RNA。

继而，Hanson等[13]又从1198个人类miRNA中，筛选出3个miRNA(miR144-5p、miR144-3p和miR185-5p)，并以此建立Logistic回归模型，该模型对经血鉴定的准确度高达100%，其检出限小于1 ng总RNA，从而在一定程度上解决了经血和阴道分泌物不易区分的难题。Zubakov等[14]从718个人类miRNA中筛选出9个用于体液鉴定的miRNA(见表1)，其灵敏度高达0.1 pg总RNA，且在实验室条件下保存1年之久的体液miRNA未发生明显降解。该研究中只有精液标记物(miR-135a，miR-10a)与Hanson等[12]的结果(精液标记物为miR-135b和miR-10b)相关，其他的miRNA标记物没有重叠。原因可能是Hanson等[12]用SYBR Green染料法而本实验用TaqMan探针法，且本实验的样本量小，不能排除miRNA表达的个体差异。Wang等[15]用TaqManRT-qPCR技术，通过建立效率校准模型证明miR-16在静脉血中特异性表达，而miR-658和miR-205不具有唾液特异性，与Hanson等[12]的研究结果不一致，同样可能是实验方法的不同造成的，此模型可提高miRNA表达数据分析的准确性和可靠性。此后，Wang等[16]在检测人唾液特异性miRNA时提出联合应用两种或三种miRNA阶梯式进行体液鉴定的新方法，不仅可以鉴定唾液，而且可以有效地鉴定其余四种体液，为体液鉴定提供了新思路。Li等[17]用线性反转录引物建立了基于体液鉴定的miRNA和DNA共提取及共分析策略，从同一样本中分析获得了4个miRNA标记物(见表1)和DNA STR谱，此方法不仅节省时间和检材，还可以一次性完成体液鉴定及STR分型。Sauer等[18]提出了检测相关体液miRNA表达水平的标准化策略，包括样本的采集、保存及目的基因的提取均采用此标准化协议，以将外部差异降到最低；同时选择合适的内源性参考基因，以补偿内源性非生物差异。此后，Sauer等[19]筛选出4种miRNA用以区分精液、唾液、阴道分泌物、静脉血、经血：miR-891 a-5 p用以准确鉴定精液；miR-144-3 p和miR-203 a-3 p结合，通过判别函数分析，区分静脉血和月经血；miR-203 a-3p和miR-124-3 p结合，通过判别函数分析，区分唾液和阴道分泌物。但在此项研究中，miR-658在唾液中缺乏特异性扩增，与Wang等[15]人的研究结果一致，而与Hanson等[12]人的研究结果矛盾，可能是由于Sauer和Wang等人使用TaqMan探针法，而Hanson等人用SYBR Green染料法所致。上述研究所用保存36年之久的外周血样本其miRNA未见明显降解。[19]

表1 miRNA用于体液鉴定的不同结果

Table 1 miRNA is used for different results of body fluid identification

由此可见，miRNA在体液鉴定方面有良好的应用价值。不同团队研究结果不一的可能原因是实验方法、检测平台及统计分析模型不同所致。因此，从最初的样本处理到实验方法、内参基因的选择及最后的统计分析模型的建立，均需要制定规范统一的准则，以提高结果的可靠性。

2 死亡时间推断

死亡时间推断对确定案发时间、划定侦察范围、认定和排除犯罪嫌疑人有重要意义。传统死亡时间的推断可根据尸体现象、胃内容物消化程度、昆虫发育情况等，但这些方法易受主观因素和环境因素的影响。近年来，随着分子生物学的快速发展，研究人员通过测定蛋白质及DNA、mRNA的含量来推断死亡时间，但上述分子不稳定，易受环境因素及酶的影响而发生降解，使其在死亡时间推断方面存在一定的局限性。miRNA因其片段短，结构稳定，且不易受外界环境因素的影响[11]，被视为死亡时间推断的一类新分子。

李文灿等[20]通过RT-qPCR检测单一温度下大鼠心肌组织miR-1-2的含量与死亡时间的关系：死后120 h内miR-1-2含量保持相对稳定，在死后早期可以作为内参基因以校正其他分子的表达水平；在死亡120 h后表现出随时间的延长而降解的趋势，提示miR-1-2可用来推断晚期死亡时间。此后，大批学者[11，21-23]进一步研究了在不同温度下不同组织的miRNA含量与死亡时间的关系：结果均表明，miRNA不受温度的影响，在死后相当一段时间内不发生降解，可作为内参标记物或推断晚期死亡时间的标志物，与李文灿等[20]的研究结果一致。

Kakimoto等[24]研究了用福尔马林固定长达3年之久的急性心肌梗死病人心肌组织中miRNA的稳定性，发现miR-191和miR-26 b的含量稳定，未发生降解，并用作为内参基因。进一步证明miRNA的稳定性及作为内参基因的可靠性。

Sharma等[25]研究发现小鼠心脏和大脑组织中AATF RNA基因组(包括AATF mRNA及其编码的miR-2909)的昼夜节律与死亡时间具有协同性，为死亡时间的推断提供了更精确可靠的方式，同时为miRNA在死亡时间推断方面的应用提供了新思路。

目前，miRNA在死亡时间推断方面的研究还局限于动物实验和单一环境，与人体和自然环境存在较大差异，需进一步对人体标本和环境温度湿度及含氧量进行综合研究，以提高准确性。

3 死亡原因分析

全面正确的死因分析为案件的侦察、审理提供有力的科学依据，关系到案件的性质及对当事人的定罪量刑，因此死因分析至关重要。常规的死因分析主要通过尸体解剖和病理检查进行，目前免疫组织化学法和分子生物学法被用来进行死因分析的研究。近年来的研究发现，miRNA可作为死因的标记物，为死因分析提供辅助参考依据，有望成为死因分析的新手段。

Courts等[26]研究发现在婴儿猝死综合症中，心脏特异性miR-1和脑组织特异性let-7 b的表达水平显著上调。表明miR-1和let-7 b可作为婴儿猝死综合症的分子标记物，为婴儿的死因分析提供辅助参考依据。Sharma等[27]在研究砷毒性RNA组学调节宿主免疫应答的过程中发现，亚砷酸钠中毒小鼠miR-2909的表达升高。提示miRNA含量的变化在毒物慢性中毒中有一定价值，可以辅助法医进行毒物分析及死亡原因推断。Yu等[28]发现了8种miRNA在淡水溺死模型中表达量增加，而在海水中减少，其中，miR-706在淡水溺死模型中的表达量比在对照组和海水溺死模型中的表达量均高，可以作为溺死模型鉴定的潜在分子标记物。Schober等[29]研究发现，用miR-138/miR-744或miR-195/miR-324-5 p可完全区分创伤性额皮质损伤死与自然死亡者。提示miRNA可用作创伤性脑损伤的标志物或评估脑损伤的严重程度，为死因分析提供依据。

4 损伤时间推断

准确推断损伤时间可以鉴别生前伤和死后伤以及确定损伤后存活时间，对于案件重建和侦破有重要意义。损伤时间推断的方法包括肉眼观察、显微镜检查和酶组织化学法、生物化学法、免疫组织化学、分子生物学法检测等，还有学者测定创口中mRNA、DNA含量来推断损伤时间。近年来，有研究显示miRNA表达谱在损伤后变化显著，可用来推断损伤时间。

彭涛等[30]研究新生大鼠缺氧缺血性脑损伤大脑皮质miRNA表达量的变化，用miRNA芯片筛选出27个miRNA表达上调超过2倍，60个下调超过2倍，又用RT-qPCR检测所选择的9个miRNA，结果与miRNA芯片趋势相同。提示miRNA的量在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤中显著变化，深入研究miRNA表达量的变化规律，可以揭示其与损伤时间之间的关系。

Sun等[31]研究了创伤性脑损伤后不同时间点大鼠海马miRNA谱的表达变化，发现17种miRNA在各时间点均有显著性变化，提示损伤后miRNA的表达变化规律具有很好的时序性。并指出miR-142-3 p和miR-221可作为创伤性脑损伤的潜在生物标记物。

5 精神疾病鉴定

确定被鉴定人在实施危害行为时的精神状态及刑事责任能力是法医精神病学的重要任务之一，这决定了被鉴定人是否要承担刑事责任。近年来的研究表明，精神病患者与miRNA的表达水平具有一定的关联性，可为精神疾病的鉴定提供新的依据。

Moreau等[32]研究了精神分裂症和躁郁症患者死后脑组织435种miRNA表达水平的变化，其中19%的miRNA表达水平下降，在躁郁症患者中表现得尤为明显，表明miRNA可作为精神疾病的一种新标记物。Liang等[33]研究发现，let-7家族启动子的基因多态性会增加重度抑郁症的风险。因此，可以通过测定let-7的基因型来辅助诊断是否患有重度抑郁症，进一步证实miRNA与精神疾病紧密相关，可为精神疾病的鉴定提供新的思路。

6 年龄推断

年龄的推断对确定尸源及判断刑事责任能力至关重要，目前主要通过骨骼和牙齿的形态特征推断年龄，但这些方法对生物痕迹身源者的年龄推断不适用。为满足法医实践的需求，研究者们检测到一些年龄相关的分子，其中包括miRNA，可作为年龄推断的参考标记物。

Hooten等[34]研究发现外周血单核细胞中9种miRNA(miR-103，miR-107，miR-128，miR-130a，miR-155，miR-24，miR-221，miR-496，miR-1538)的表达丰度在老年组中显著低于年轻组，提示在人类的衰老过程中伴随着miRNA表达的变化，miRNA可作为年龄推断的标记物。Hackl等[35]研究细胞和机体衰老模型中miRNA表达量的变化，发现miR-17、miR-19 b、miR-20 a和miR-106 a均呈现出下调，以miR-17下调最为显著，进一步证实miRNA的表达量具有随年龄变化的规律。同样，Li等[36]研究发现，mir-223、let-7 d和mir-130 a调节人类衰老过程；Rubie等[37]提出，miR-496通过控制雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路参与人类衰老的调节过程。这些研究结果提示，miRNA可作为年龄推断的新型标记物，为年龄的推断提供新思路。

综上所述，miRNA的应用在法医学中表现出巨大潜力，涉及法医学中的多个方向，为体液鉴定、死亡时间推断、死亡原因分析、损伤时间推断、精神疾病鉴定及年龄推断提供了一个新的视角。但目前对其研究仍处于实验室阶段，且不同团队得出的结果各异。因此，如何将实验室研究结果应用于法医学实践当中且建立可靠的标准实验流程是未来研究的重点。由于miRNA参与众多疾病的发生发展过程，在机体不同的病理生理状态下其表达量有差异，因此会影响其在法医学中应用的准确性，故只能对健康个体进行miRNA相关法医学推断。

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10.13452/j.cnki.jqmc.2016.03.013

2016-05-02

董智杰(1990～)，女，汉族，河南籍，2014级科学班研究生