血浆MicroRNA-134在西宁地区急性肺栓塞患者中的诊断价值※

王亚平，赵 振，张 恒，多 杰

(青海省人民医院呼吸科，青海 西宁 810007)



血浆MicroRNA-134在西宁地区急性肺栓塞患者中的诊断价值※

王亚平，赵 振，张 恒，多 杰*

(青海省人民医院呼吸科，青海 西宁 810007)

目的 通过检测血浆MicroRNA-134相对表达水平，探讨其在西宁地区急性肺栓塞患者诊断中的临床价值。方法 选取西宁地区急性肺栓塞患者、慢性肺栓塞患者及健康体检者各20例，采用Real-timePCR法分别检测各组患者血浆MicroRNA-134表达水平，使用ROC曲线评价MicroRNA-134在西宁地区急性肺栓塞患者中的诊断价值。结果 (1)MicroRNA-134在急性肺栓塞组中的表达水平显著高于慢性肺栓塞组及健康对照组，慢性肺栓塞组的表达水平高于健康对照组，差异均具有统计学意义(P<0.05)；(2)通过ROC曲线评估MicroRNA-134对急性肺栓塞患者的诊断价值，与D-二聚体作对照，两者敏感性一致(均为100%)，其中MicroRNA-134特异性优于D-二聚体(分别为71.41%，66.7%)。结论 血浆miRNA-134在西宁地区急性肺栓塞患者诊断中具有较高的临床价值，可作为其诊断的潜在生物学标志物。

肺栓塞 MicroRNA-134 D-二聚体

寻找对肺栓塞诊断价值高、无创、简便的诊断方法具有较大的现实意义。随着医学分子生物学的飞速发展，寻找具有重要诊断价值的分子生物学标志物是当前研究的热点。

MicroRNA(miRNA)是一种内源性非编码单链小RNA，存在于真核细胞生物体内，与靶基因mRNA的3′非编码区结合，使其翻译受到阻碍，完成对基因的调控，从而参与了机体许多生物进程，如细胞分裂增殖、血管生成、细胞代谢等[1-2]。由于循环miRNA可稳定存在于体内且不易被酶分解，其非常适合作为机体疾病诊断的生物学标志物。目前在心功能衰竭、心肌梗死、脊髓损伤中已经筛选出了具有特异诊断价值的miRNA[3-8]。西宁地区平均海拔2260 m，轻度低氧为其主要的环境特点，该地区肺栓塞发病率及病死率较高。因此，筛选出适合本地区的具有明确诊断价值、无创、简便的分子生物学标志物尤为重要。本研究通过检测肺栓塞患者血浆miRNA-134表达水平，并与传统血浆标志物D-二聚体进行诊断价值比较，探讨miRNA-134在西宁地区急性肺栓塞患者诊断中的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2014年3～10月青海省人民医院住院治疗的西宁地区急性肺栓塞患者、慢性肺栓塞患者各20例为观察组，并选取西宁地区门诊健康体检者20例为对照组。急性肺栓塞组患者男性14例，女性6例，慢性肺栓塞组患者男性13例，女性7例，健康对照组男性15例，女性5例，各组在性别分布(χ2=0.48，P=0.788)及年龄组成上无明显统计学差异(P>0.05)，各组间D-二聚体、肺动脉压、氧分压之间存在统计学差异(P<0.05)(见表1)。

Table 1 Basic clinical data of the three ±s)

*：与健康对照组比较，P<0.05；△：与慢性肺栓塞组比较，P<0.05.

所有人群均需完善常规检查项目：血常规、血气、血浆D-二聚体、心电图、心脏彩超、双下肢血管彩超、胸片等。肺栓塞的诊断根据2001年中华医学会呼吸病学分会《肺血栓栓塞症的诊断与治疗指南》，完成常规检查及CT肺动脉造影明确诊断，急性肺栓塞为发病1个月以内，慢性肺栓塞为发病超过3个月，排除原发性肺动脉高压症、重症感染、恶性肿瘤、急性冠脉综合征等重大疾病患者及精神异常不能配合者。

1.2 主要仪器及试剂

低温超速离心机(HEMR)，ABI7500荧光实时定量PCR仪(ABI)，TRIzol RNA提取试剂盒(Invitrogen)，TIANGEN Script RT Kit(Tiangen)，2×SYBR Premix Ex Taq(ABI )。

1.3 引物序列

通过查阅相关外文文献及反复验证，获取目的基因miRNA-134及内参基因U6的引物序列，所有引物序列均由Invitrogen公司纯化合成，引物终浓度及序列为，目的基因：miRNA-134-human-f(400nmol/L)：5′-ACACTCCATCTGGGTGTGACTGGTTGACCAGA-3′，miRNA-134-human-r(400nmol/L)：5′-CTCAAC GTGTCGTGGA-3′；

内参基因：U6-human-f(400nmol/L)：5′-TAAAATCTATATACACGACGGCTTCG-3′，U6-human-r(400nmol/L)：5′-TACTGTGCGTTTAAGCACTTCGC-3′。

1.4 血浆样本及总RNA

采集清晨空腹血4 mL置入EDTA抗凝管中，4 ℃离心提取血浆，分装后置-80 ℃冰箱冷冻储存，用于批量检测；血浆总RNA提取采用TRIzol RNA提取试剂盒，操作严格按照试剂盒说明书进行。应用紫外分光光度仪测定OD比值(A260/A280)、琼脂糖凝胶电泳测定血浆总RNA的浓度及质量，选取OD值介于1.8～2.0之间、浓度大于或等于2 μg/μL者，作为实验样品冻存。

1.5 第一链cDNA

将RNA模板批量在冰上解冻，所有RNA模板的浓度调整为2 μg/μL，采用FastQuant RT Kit试剂盒逆转录合成第一链cDNA，操作严格按照试剂盒说明书进行，得到的cDNA用于后续荧光实时定量PCR实验。

1.6 血浆miRNA-134表达水平

采用荧光实时定量PCR法测定血浆miRNA-134表达水平，首先制作标准曲线，以样品cDNA原浓度为起始浓度依次稀释，稀释因子为2，共稀释5个浓度。根据标准曲线优化反应体系，使得目的基因和内参基因的扩增效率相一致。

PCR反应体系(20μL体系)：2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL(Applied Biosystems)，第一链cDNA 1 μL，目的基因miRNA-134及内参基因U6上、下游引物各1 μL，用灭菌双蒸水补齐至20 μL。实验在ABI7500荧光实时定量PCR仪中进行，每个样品设3个重复孔，每组样品进行1次重复。目的基因与内参基因的PCR反应条件一致，95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s，65 ℃ 30 s，40个循环，70 ℃ 30 s，反应结束后根据获取的循环阈值(CT值)，采用相对定量法计算2-△△CT值，分析数据。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 三组间miRNA-134的表达水平比较

采用Real-time PCR法检测三组人群血浆miRNA-134的表达水平，结果显示，急性肺栓塞组血浆miRNA-134表达水平显著高于慢性肺栓塞组及健康对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，慢性肺栓塞组表达水平高于健康对照组(P<0.05)。(表2)

Table 2 Comparison of plasma miRNA-134 expression in three ±s)

注：*与健康对照组比较P<0.05；△与慢性肺栓塞组比较P<0.05.

2.2 miRNA-134在急性肺栓塞诊断中的价值评价

采用ROC曲线分析评判血浆miRNA-134在急性肺栓塞中的诊断价值，并与经典血浆诊断指标D-二聚体做比较，结果显示，miRNA-134、D-二聚体所对应的曲线下面积(AUC)分别为0.876、0.794，对急性肺栓塞诊断均具有统计学意义(P<0.05)，而miRNA-134的AUC更高(图1)；ROC曲线上左上角值表示灵敏性和特异性两者总和最大值，以该点作为诊断急性肺栓塞的最佳临界值，确定miRNA-134和D-二聚体诊断急性肺栓塞的最佳临界值分别为1.07、5.40 ug/mL；以最佳临界值作为判断标准，分别计算miRNA-134和D-二聚体诊断急性肺栓塞的灵敏度和特异度，结果显示两者敏感性一致，但miRNA-134的特异性优于D-二聚体(表3)。

图1 miRNA-134、D-二聚体诊断急性肺栓塞的ROC曲线

Figure 1 ROC curve of miRNA-134 and D-dimer for acute pulmonary embolism diagnosis

表3 miRNA-134、D-二聚体在急性肺栓塞诊断中的ROC曲线分析结果

Table 3 ROC curve of miRNA-134 and D-dimer for acute pulmonary embolism diagnosis

3 讨论

本研究采用Real-time PCR法检测西宁地区肺栓塞患者血浆miRNA-134表达水平，结果发现，急性肺栓塞组血浆miRNA-134表达水平显著高于慢性肺栓塞组及健康对照组，慢性肺栓塞组表达水平高于健康对照组；并与经典血浆诊断指标D-二聚体做比较，miRNA-134在西宁地区急性肺栓塞患者中具有较高的诊断价值，且特异性优于D-二聚体。

已知肺栓塞以其高发病率、高死亡率和高致残率成为全球关注的焦点，其诊断方法目前主要有临床可能性评估、实验室辅助检查(包括动脉血气分析、血浆D- 二聚体检测等)以及影像学诊断(包括胸部X 线、彩色多普勒超声、肺动脉造影等)。上述各种诊断方法，在检查条件、技术要求及患者配合度等方面均有较高的要求，限制了其在临床的应用。

已知miRNA可对基因进行转录后的调控[9-10]，在各组织、细胞及血清中表达具备特异性和稳定性[11]，且含量稳定，适合做生物标记。国外的一项研究发现[12]，急性肺栓塞患者血浆中miR-134的表达水平较正常人增高了10倍以上，可能是诊断急性肺栓塞的新的潜在血浆生物学标志物，其与我们的研究结果基本一致。认为当发生急性肺栓塞时，细胞缺血、缺氧致变性、坏死，使细胞膜通透性改变，此时肺高度特异性表达的miRNA-134以微泡形式从受损的细胞质中释放到外周血中。

本研究发现，miRNA-134在急性肺栓塞患者诊断中具有较高的敏感性及特异性，且特异性明显优于经典肺栓塞血浆诊断指标D-二聚体，我们认为血浆miR-134的表达水平能够区分急性肺栓塞患者、非急性肺栓塞患者及健康人群，血浆miR-134检测可作为临床上诊断急性肺栓塞更为理想的生物学标志物。但近期相关的研究发现，外周血单核细胞中miR-134在不稳定性心绞痛及心肌梗塞患者中的表达水平明显高于稳定性心绞痛患者及健康人群，miR-134的表达水平与发生心力衰竭的危险因素密切相关，其可能是心肌梗死的一个潜在预测指标[13-14]。也有研究发现[15-16]，miR-134与神经系统疾病的发病机制密切相关，在鳞状细胞癌组织中的表达水平也较正常组织升高[17]。因此，我们在诊断急性肺栓塞时需尽量排除合并有心血管系统、神经系统、肿瘤等其他疾病的患者，以确保试验结果准确可靠。

综上所述，血浆miRNA-134具有较高的敏感性及特异性，有望成为西宁地区临床上诊断急性肺栓塞新的预测指标，为临床提高早期治疗的可能性。但由于本研究例数较少、对照病例不够全面，试验复杂、技术难度大等客观因素，仍需继续提高试验技能、改进试验方法、扩大研究范围进行更深入的研究。

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The diagnostic value of plasma MicroRNA-134 for patients with acute pulmonary embolism at Xining area※

Wang Yaping，Zhao zhen，Zhang Heng，Duo Jie*

(Respiratory Department of Qinghai Provincial People′s Hospital，Xining，810007)

Objective To discuss the clinical diagnostic value of MicroRNA-134 in patients with acute pulmonary embolism at Xining area.Methods 20cases of patients with acute pulmonary embolism，20cases of chronic pulmonary embolism and 20cases of healthy volunteers were selected in trial groups.The plasma levels of MicroRNA-134 in each group were measured by Real-time PCR，and the clinical diagnostic value of miRNA-134 for patients with acute pulmonary embolism at Xining area were evaluated by using ROC curve.Results (1) The levels of miRNA-134 in acute pulmonary embolism group were obviously higher than that of the chronic pulmonary embolism and healthy control groups，and the levels of miRNA-134 in chronic pulmonary embolism group were higher than that of the healthy control group，the differences were statistically significant(P<0.05).(2)The clinical diagnostic value of miRNA-134 for patients with acute pulmonary embolism were evaluated by using ROC curve.Compared with the levels of D-dimer，there are the same sensitivities(100%)，but the specificity of miRNA-134 was better than that of D-dimer(71.41%，66.70%，respectively).Conclusions It shows that the plasma miRNA-134 has high diagnostic value for acute pulmonary embolism，it can be used as a potential biological markers for diagnosis of acute pulmonary embolism.

Pulmonary embolism MicroRNA-134 D-dimer

R322.3

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.03.001

2016-05-07

※：青海省科学技术厅应用基础研究计划项目(2014-ZJ-763)；*：通讯作者，主任医师，0971-8066256 王亚平(1982～)，女，汉族，甘肃籍，博士，主治医师