超滤法结合HPLC法测定白藜芦醇的血浆蛋白结合率

鲍慧玮　侯晓琳　刘芳馨　刘佳　李丽静

【摘 要】 目的：建立测定白藜芦醇与大鼠、小鼠、家兔血浆蛋白结合率的方法，并测定其结果，为白藜芦醇的药代动力学及临床用药提供参考。方法：采用超滤法结合HPLC法对白藜芦醇与大鼠、小鼠和家兔血浆的蛋白结合率进行测定。结果：白藜芦醇在0521～2297μg的线性关系良好，标准曲线为Y=11434X-00409（r=09995）。白藜芦醇与大鼠血浆、小鼠血浆和家兔在0504μg/mL、504μg/mL、2016μg/mL的含药血浆中的蛋白结合率为（9032±009）%、（8932±004）%、（9152±012）%。结论：该方法重复性和专属性好，操作简单、快捷，能够满足样品定量分析测定要求；测定结果表明，白藜芦醇与血浆蛋白有很强的结合，且在考察范围内蛋白结合率对血药浓度无明显的依赖性。

【关键词】 白藜芦醇；超滤法；HPLC；血浆蛋白结合率

【中图分类号】R2841 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）20-0023-04

白藜芦醇（trans-3，5，4-o-trihydroxystilbene）是存在于虎杖、花生、桑椹、葡萄等植物中的一种生物活性极强的多酚类物质，具有抗肿瘤[1]、抗氧化[2]和抗炎[3]等多方面作用，且在抑制血小板聚集、预防腹部、心脏病、关节等外科手术后纤维组织粘连和舒张血管方面也具有良好的药理活性[4-6]。近年来其颇受关注和研究，是一种潜在开发的药物。但其在药代动力学方面研究较少，尤其在血浆蛋白结合率方面并无研究。而药物的血浆蛋白结合率是药代动力学中重要参数，与药物在体内的吸收、代谢、分布和排泄等密切相关[7-8]，对今后其新药的研发和临床应用具有重要的意义[9-11]。实验采用超滤法和HPLC结合的方法[12-15]对白藜芦醇和大鼠、小鼠、家兔的血浆蛋白结合率进行研究，为对白藜芦醇药代动力学的研究提供参考。

1 仪器与材料

11 仪器 Agilent1260型高效液相（含DAD检测器，美国Agilent有限公司）；WP-UP-III-10沃特浦实验室用超纯水器（四川沃特尔科技发展有限公司）；超滤管（醋酸纤维素膜，相对分子质量截留值10kD，Millopore公司）；TG1650-WS 型高速离心机（上海卢湘仪）；SK-1快速混匀器（江苏金坛市江南仪器制造厂）；AVW20D型电子天平（日本岛津制作所）。

12 试药 白藜芦醇（批号：111535-200502，中国药品生物制品鉴定所）；甲醇（色谱纯，美国FISHER公司）；超纯水（自制）；磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钠、磷酸氢二钾等均为分析纯。

13 动物 SD大鼠，雄性，体重（200±20）g，由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供（合格证号：SCXK（吉）2011-0004），毛细管眼眦取血，置肝素钠抗凝离心管中，3000r/min离心10min，分离血浆，置于4℃冰箱中冷冻备用。SD小鼠，雄性，体重（200±20）g，由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供（合格证号：SCXK（吉）2011-0004），毛细管眼眦取血，置肝素钠抗凝离心管中，3000r/min离心10min，分离血浆，置于4℃冰箱中冷冻备用。实验兔，雄性，体重18～22kg，由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供（合格证号：SCXK（吉）2012-0002），毛细管眼眦取血，置肝素钠抗凝离心管中，3000r/min离心10min，分离血浆，置于4℃冰箱中冷冻备用。

2 方法与结果

21 色谱条件 Venusil MP-C18（250mm×46mm，5μm）色谱柱，流动相为甲醇-水（V∶V=45∶55），流速1mL/min，柱温为30℃，检测波长为290nm，进样量为10μL，理论塔板数按照白藜芦醇计算不低于2000，且与其他物质分离度良好，符合药典规定。

22 溶液配制

221 等渗PBS溶液的配制 分别称取磷酸二氢钾259g，磷酸氢二钾1411g，氯化钠199g，磷酸氢二钾1411g，置于1000mL容量瓶中，加入适量超纯水，超声溶解，超纯水定容至刻度，摇匀，即为等渗PBS溶液。

222 对照品溶液的配制 精密称取白藜芦醇对照品约5mg，置1L容量瓶中，加入适量等渗PBS，均匀混合，定容至刻度，摇匀，即得浓度约为5μg/mL的白藜芦醇储备液。

223 供试品溶液的配制 精密称取白藜芦醇标准品252mg，置于50mL容量瓶中，加入等渗PBS溶液适量，充分溶解，定容至刻度，摇匀。分别吸取025、25、100mL加入25mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，得浓度为504、504、2016μg/mL的PBS溶液。分别精密吸取50μL，置于450μL空白大鼠、小鼠、家兔血样中，均匀混合，得到浓度为0504、504、2016μg/mL的高、中、低浓度的血浆样品。分别置于37℃水浴锅中温预3h后，将温预后的大鼠血浆、小鼠血浆和家兔血浆移至超滤管中，6000r/min离心15min，得到各血浆超滤液，即得高、中、低浓度的供试品，在4℃下保存。

23 专属性考察 取空白大鼠血浆、小鼠血浆和家兔血浆各400μL，分别置于37℃水浴锅中温预3h后，将温预后的大鼠血浆、小鼠血浆和家兔血浆移至超滤管中，6000r/min离心15min，得到空白血浆超滤液。分别将白藜芦醇对照品、空白血浆超滤液和供试品溶液按照“21”项下色谱条件进入高效液相，白藜芦醇对照品峰形良好，且与其它峰分离度良好，具有良好的专属性，见图2、3、4。

24 线性关系考察 精密称取白藜芦醇标准品252mg，置于50mL容量瓶中，加入等渗PBS溶液适量，充分溶解，定容至刻度，摇匀。分别吸取01、02、10、20、40、50mL加入100mL容量瓶中，

定容至刻度，摇匀，得浓度为0504、1008、504、1008、2016、252μg/mL的PBS溶液。按照“21”项下色谱条件方法进入高效液相色谱中，记录峰面积，以白藜芦醇的峰面积为纵坐标（Y），浓度为横坐标（X）进行线性回归，计算回归方程为Y=11434X-00409（r=09995），线性范围为0504～252μg。

25 精密度考察

251 PBS液精密度考察 取“24 线性关系考察”中浓度为0504、504、2016μg/mL的低、中、高浓度的白藜芦醇对照品溶液，连续进样6d，计算日内精密度的RSD值，连续进样6d，计算日间精密度RSD，结果见表1。

252 超滤液精密度考察 取“223”项下供试品溶液，连续进样6次，计算日内精密度的RSD值，连续进样6d，计算日间精密度RSD，结果见表1。

26 稳定性考察

261 PBS溶液稳定性考察 取“24 线性关系考察”中浓度为0504、504、2016μg/mL的低、中、高浓度的白藜芦醇对照品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12、24h进入高效液相色谱仪中，记录峰面积，计算RSD值，结果见表1。

262 超滤液稳定性考察 取“223”项下供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12、24h进入高效液相色谱仪中，记录峰面积，计算RSD值。

27 超滤液回收率的考察 取“24 线性关系考察”中浓度为0504、504、2016μg/mL的低、中、高浓度的白藜芦醇对照品溶液，分别吸取400μL，置于超滤管中，以6000r/min离心15min，吸取超滤液，按照“21”项下色谱条件进入高效液相色谱仪，与相应对照品溶液峰面积对比计算回收率。结果超滤膜回收率均≥95%，证明超滤膜对白藜芦醇无特异性吸附。

28 血浆蛋白结合率实验 取“252”项下中0504、504、2016μg/mL的低、中、高3个浓度的大鼠、小鼠、家兔样品，分别吸取400μL，置于超滤管中，以6000r/min离心15min，得到空白血浆超滤液。按照“21”项下色谱条件进入高效液相，计算其血浆蛋白结合率。

蛋白结合率=ρ超滤前-ρ超滤后ρ超滤前×100%

式中：ρ超滤前为超滤前溶液中白藜芦醇的质量浓度，μg/L；ρ超滤后为超滤液中白藜芦醇的质量浓度，μg/L。

数据经SPSS 130软件进行方差分析，结果表明低、中、高3种浓度的供试品溶液与大鼠、小鼠和家兔的血浆蛋白结合率无统计学差异。

3 讨论

31 波长的选择 通过DAD检测器，在各波长下，对不同色谱条件超滤液和对照品进行分析。最终确定在波长为290nm时，样品分离效果最好，与其它杂质的分离度均符合药典药典规定。

32 测定方法的选择 据文献报道[16]，有多种血浆蛋白结合率测定的方法，常用的有超滤法、平衡透析法、凝胶过滤法、白蛋白微球测定法、超速离心法等。实验采用超滤法，其是一种经典的测定方法，具有样品测定准确、速率高、成本低等显著优势，适用于大量样品的测定。超滤法减少了非特异性的表面吸附，缩短了平衡时间，加快了待测样品的测定时间，且不受稀释效应和体积迁移的影响。

33 超滤管的选择 实验选用截留向相对分子质量为10K的超滤管，可以将超滤管内的血浆蛋白、内源性物质及其他成分在透析的过程中稳定的保存于超滤管滤膜内，不对样品进行干扰，可以很好的测定白藜芦醇与大鼠、小鼠和家兔血浆蛋白的结合率。

34 样品的选择和意义 白藜芦醇在抗肿瘤、抗氧化和抗炎等多方面性质等方面都有良好的药理作用，是一种很有潜力的药品[10-11]，但对于其血浆蛋白结合率并没有研究。白藜芦醇药物被吸收后部分呈游离的分子状态，这部分游离的药物分子能从血液中进入作用部位，并发挥药理作用，与血浆蛋白结合的药物却没有药理活性。当游离的白藜芦醇被代谢或者进入组织后，部分与血浆蛋白结合的白藜芦醇又可以分开并弥补游离的药物。药物的这种可逆性结合可以影响白藜芦醇的药代动力学、作用时间、作用强度都密切相关，且与其作用机制、药物相互作用等密切相关，故本试验对白藜芦醇的血浆蛋白结合率的研究具有重要意义。

研究结果显示，白藜芦醇具有高蛋白结合率，可使其在体内的表观分布容积相对较大，半衰期增长，肾清除速率减慢；通过对大鼠、小鼠和家兔的超滤液色谱图对比，结果发现它们色谱图基本相同，可能因为血浆蛋白其成分相似。此方法适用于大鼠、小鼠、家兔的血浆蛋白蛋白结合率的测定，其对药代动力学和临床应用也有极大的意义。

参考文献

[1] Chow S E， Kao C H， Liu Y T A， et al. Resveratrol induced ER expansion and ER caspase-mediated apoptosis in human nasopharyngeal carcinoma cells[J]. Apoptosis， 2014， 19（3）： 527-541.

[2]Hangun-Balkir Y， McKenney M L. Determination of antioxidant activities of berries and resveratrol[J]. Green Chemistry Letters and Reviews， 2012， 5（2）： 147-153.

[3]Riveiro-Naveira R R， Loureiro J， Valcárcel-Ares M N， et al. Anti-inflammatory effect of resveratrol as a dietary supplement in an antigen-induced arthritis rat model[J]. Osteoarthritis and Cartilage， 2014， 22： 290.

定容至刻度，摇匀，得浓度为0504、1008、504、1008、2016、252μg/mL的PBS溶液。按照“21”项下色谱条件方法进入高效液相色谱中，记录峰面积，以白藜芦醇的峰面积为纵坐标（Y），浓度为横坐标（X）进行线性回归，计算回归方程为Y=11434X-00409（r=09995），线性范围为0504～252μg。

25 精密度考察

251 PBS液精密度考察 取“24 线性关系考察”中浓度为0504、504、2016μg/mL的低、中、高浓度的白藜芦醇对照品溶液，连续进样6d，计算日内精密度的RSD值，连续进样6d，计算日间精密度RSD，结果见表1。

252 超滤液精密度考察 取“223”项下供试品溶液，连续进样6次，计算日内精密度的RSD值，连续进样6d，计算日间精密度RSD，结果见表1。

26 稳定性考察

261 PBS溶液稳定性考察 取“24 线性关系考察”中浓度为0504、504、2016μg/mL的低、中、高浓度的白藜芦醇对照品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12、24h进入高效液相色谱仪中，记录峰面积，计算RSD值，结果见表1。

262 超滤液稳定性考察 取“223”项下供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12、24h进入高效液相色谱仪中，记录峰面积，计算RSD值。

27 超滤液回收率的考察 取“24 线性关系考察”中浓度为0504、504、2016μg/mL的低、中、高浓度的白藜芦醇对照品溶液，分别吸取400μL，置于超滤管中，以6000r/min离心15min，吸取超滤液，按照“21”项下色谱条件进入高效液相色谱仪，与相应对照品溶液峰面积对比计算回收率。结果超滤膜回收率均≥95%，证明超滤膜对白藜芦醇无特异性吸附。

28 血浆蛋白结合率实验 取“252”项下中0504、504、2016μg/mL的低、中、高3个浓度的大鼠、小鼠、家兔样品，分别吸取400μL，置于超滤管中，以6000r/min离心15min，得到空白血浆超滤液。按照“21”项下色谱条件进入高效液相，计算其血浆蛋白结合率。

蛋白结合率=ρ超滤前-ρ超滤后ρ超滤前×100%

式中：ρ超滤前为超滤前溶液中白藜芦醇的质量浓度，μg/L；ρ超滤后为超滤液中白藜芦醇的质量浓度，μg/L。

数据经SPSS 130软件进行方差分析，结果表明低、中、高3种浓度的供试品溶液与大鼠、小鼠和家兔的血浆蛋白结合率无统计学差异。

3 讨论

31 波长的选择 通过DAD检测器，在各波长下，对不同色谱条件超滤液和对照品进行分析。最终确定在波长为290nm时，样品分离效果最好，与其它杂质的分离度均符合药典药典规定。

32 测定方法的选择 据文献报道[16]，有多种血浆蛋白结合率测定的方法，常用的有超滤法、平衡透析法、凝胶过滤法、白蛋白微球测定法、超速离心法等。实验采用超滤法，其是一种经典的测定方法，具有样品测定准确、速率高、成本低等显著优势，适用于大量样品的测定。超滤法减少了非特异性的表面吸附，缩短了平衡时间，加快了待测样品的测定时间，且不受稀释效应和体积迁移的影响。

33 超滤管的选择 实验选用截留向相对分子质量为10K的超滤管，可以将超滤管内的血浆蛋白、内源性物质及其他成分在透析的过程中稳定的保存于超滤管滤膜内，不对样品进行干扰，可以很好的测定白藜芦醇与大鼠、小鼠和家兔血浆蛋白的结合率。

34 样品的选择和意义 白藜芦醇在抗肿瘤、抗氧化和抗炎等多方面性质等方面都有良好的药理作用，是一种很有潜力的药品[10-11]，但对于其血浆蛋白结合率并没有研究。白藜芦醇药物被吸收后部分呈游离的分子状态，这部分游离的药物分子能从血液中进入作用部位，并发挥药理作用，与血浆蛋白结合的药物却没有药理活性。当游离的白藜芦醇被代谢或者进入组织后，部分与血浆蛋白结合的白藜芦醇又可以分开并弥补游离的药物。药物的这种可逆性结合可以影响白藜芦醇的药代动力学、作用时间、作用强度都密切相关，且与其作用机制、药物相互作用等密切相关，故本试验对白藜芦醇的血浆蛋白结合率的研究具有重要意义。

研究结果显示，白藜芦醇具有高蛋白结合率，可使其在体内的表观分布容积相对较大，半衰期增长，肾清除速率减慢；通过对大鼠、小鼠和家兔的超滤液色谱图对比，结果发现它们色谱图基本相同，可能因为血浆蛋白其成分相似。此方法适用于大鼠、小鼠、家兔的血浆蛋白蛋白结合率的测定，其对药代动力学和临床应用也有极大的意义。

参考文献

[1] Chow S E， Kao C H， Liu Y T A， et al. Resveratrol induced ER expansion and ER caspase-mediated apoptosis in human nasopharyngeal carcinoma cells[J]. Apoptosis， 2014， 19（3）： 527-541.

[2]Hangun-Balkir Y， McKenney M L. Determination of antioxidant activities of berries and resveratrol[J]. Green Chemistry Letters and Reviews， 2012， 5（2）： 147-153.

[3]Riveiro-Naveira R R， Loureiro J， Valcárcel-Ares M N， et al. Anti-inflammatory effect of resveratrol as a dietary supplement in an antigen-induced arthritis rat model[J]. Osteoarthritis and Cartilage， 2014， 22： 290.