维生素D检测方法的研究进展

顿中华

摘要：应用高效液相色谱法、液质联用法、放射免疫法、酶联免疫法、化学发光免疫法、电化学发光免疫法、全自动生化法等检测血清25-（OH）D浓度，可根据测定结果对人体维生素D的营养状况做出评价，因此，在方法选择时，应根据测定灵敏度、特异性、测定费用、测定时间及实验人员能力和实验室条件等实际情况进行综合考虑。为此，笔者对有关研究进展进行综述。

关键词：维生素D；钙代谢；25.羟基维生素D；全自动生化

中图分类号：R446.112 文献标志码：A 文章编号：1008—2409（2016）04—0171—06

维生素D是人体必需的营养素，其营养状况影响着人体钙和磷的正常代谢，与人体健康密切相关，因此，准确测量维生素D水平对于多种钙代谢相关疾病的预防和治疗有重要意义。维生素D在血液中主要以25-羟基维生素D[25-（OH）D]的形式运输，是评价体内维生素D营养状况最为有效的指标。高效液相色谱法、液质联用法、放射免疫法、酶联免疫法、化学发光免疫法、电化学发光免疫法、全自动生化法等方法均可检测血清25-（OH）D浓度，并根据测定结果对人体维生素D的营养状况做出评价。笔者就常用的血清25-（OH）D浓度的检测方法和各自特点作一综述。

1维生素D概述

维生素D是人体必需的营养素，在自然状态下，日光照射或植物性食物是维生素D的重要来源。维生素D是类固醇衍生物，其家族最重要的成员是维生素D₂和维生素D₃。维生素D₂多含于植物性食物中，它是由植物的麦角固醇经阳光照射而合成的，维生素D₃可由人体皮肤和脂肪组织在7-脱氢胆固醇经过阳光照射合成，这两种形式的维生素D均无生物活性，必须在体内经过两次羟化后方能发挥生物效应。维生素D属脂溶性维生素，来自食物中的维生素D₂与脂肪一起经小肠吸收，在胆汁协助下形成乳糜微粒，由淋巴管进入血液，与阳光照射合成的维生素D，一起转运入肝脏。维生素D在肝脏中经干细胞微粒体中的25-羟化酶作用下，转化为25-羟基维生素D_[25-（OH）D]，再经过肾脏中线粒体1α羟化酶系统的作用下转变为有生物活性的1，25-羟基维生素D[1，25-（OH）₂D]。维生素D、25-（OH）D、1，25-（OH）：D在人体内的半衰期分别为24 h、2周和4h。维生素D在血液中主要以25-（OH）D的形式运输，其浓度最高，最稳定，而且半衰期最长，能反映食物摄入和日光照射合成的维生素D总量，因此，血清25-（OH）D浓度是评价体内维生素D营养状况最为有效的指标。通常将维生素D缺乏定义为血清25-（OH）D水平低于20ng/ml，不足为20～30ng/ml，充足为30ng/ml以上。

维持正常的维生素D水平对调节钙磷代谢至关重要。具有生物活性的1，25-（OH）₂D可以促进肠道钙结合蛋白的合成，通过下述3个方面使血清钙、磷含量增高；首先，促进肠道内钙、磷的吸收和运转，增加在体内的留存；其次，提高肾小管对钙、磷离子的再吸收，使尿钙、磷排出减少；最后，当低血钙膳食中缺钙时，在甲状旁腺素（PTH）的作用下促进钙、磷的吸收，动员骨中钙、磷释出。在维生素D缺乏的情况下，食物中的钙只有10%—15%能够被吸收，磷只有60%能够被吸收。1，25-（OH）₂d通过与维生素受体结合，可提高肠道对钙磷的吸收效率，使钙吸收增加至30%～40%，磷增加至80%左右。众所周知，维生素D具有传统意义上的骨骼效应，近年来研究显示，维生素D不仅能够调节钙磷平衡和骨骼代谢，还具有调节免疫、抗肿瘤、调控细胞增殖、防治代谢综合征、抗炎、保护心血管健康等多种生物学功能。

然而，维生素D缺乏或不足的状况在全球范围内普遍存在，按照国际上对维生素D状态评价的普遍标准，全球已有50%的人口存在维生素D缺乏的风险。维生素D缺乏可能导致儿童佝偻病、新生儿低血钙、甲状腺功能减退、中老年人骨质疏松、骨软化症等多种钙代谢异常疾病，而且可使患高血压、冠心病的危险性增加。但长期或大剂量过多使用维生素D也会发生中毒，过量维生素D可导致高钙血症及多种衰老相关疾病，因此，有必要探索建立可靠、高效的测定方法，为维生素D的检测、相关疾病的诊断和预防提供有力的科学依据。

2维生素D的检测方法

现有多种方法用于测定血清25-（OH）D浓度来评价机体维生素D的营养状况，根据方法原理不同，可分为色谱分析法和免疫分析法。色谱分析法包括高效液相色谱法（HPLC）和液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS），可分离并检测不同的分析物，能区分并分别定量25-（OH）D₂和25-（OH）D₅。免疫分析法包括放射免疫法（RIA）、酶联免疫吸附法（ELISA）、化学发光免疫测定法（CLIA）、电化学发光免疫测定法（ECLIA）、全自动生化分析法等，由于所有的维生素D羟化物都能发生抗体抗原结合反应，因此，只能测定25-（OH）D总量，无法同时测定25-（OH）D₂和25-（OH）D₃的浓度。

2.1高效液相色谱法（HPLC）

高效液相色谱法（HPLC）是早期应用较多的色谱法之一，可以同时检测25-（OH）D₂和25-（OH）D₃，其灵敏度、特异性和准确性都较高，与LC-MS/MS法的结果一致性较好。与免疫法相比，HPLC的相对不确定度小，分析操作省时省力，具有分离效能高、分析速度快、重复性好、节约成本、精确度高、可自动化等优点。但是HPLC的不足之处是设备较贵，检测通量小，所需样品量大，标本前处理过程复杂，对操作人员要求较高等，目前临床使用较少。而且，HPLC虽然能够分开25-（OH）D₂和25-（OH）D₃，但25-（OH）D₂浓度太低，HPLC检测限达不到要求。随着监测技术及精度的发展，FIPLC逐步被LC-MS/MS法所替代。

王剑建立HPLC法测定正常儿童血清25-（OH）D₃含量并评价其应用。样品用甲醇沉淀蛋白，以10%二氯甲烷-正己烷提取；甲醇—水（88：12）为流动相，选用Diamonsil^Tm（250 min×4.6 mm，5μm）色谱柱进行分离，流速为1 ml/min，检测波长为265 mm，柱温30℃。以25-（OH）D₃标准品外标法建立标准曲线，结果发现，该方法在10～200μg/L浓度范围内线性关系好（r=0.9971），方法回收率为93.4%～106.2%，提取回收率为88.8%～94.1%。同时也获得了较好的精度，日内变异系数（CV）为3.5%～4.4%，日间CV为3.9%～4.7%，最小检测范围为5 μg/L。刘怡欣利用HPLC法测定健康成年人血清25-（OH）D₃含量，建立方法学与上一研究类似，结果发现，25-（OH）D，在线性范围8～160μg/L内与其响应值线性关系良好（r=0.9999），平均回收率为92.5%～109.5%，日内精密度（RSD）为2.0%～4.6%，日间RSD为2.9%～5.2%，最小检测范围为4μg/L。此方法检测25-（0H）D具有较高的回收率、较好的精密度和准确性，可用于临床实验室开展血清25-（OH）D含量测定。

2.2液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）

液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）是色谱法中最为常用的25-（OH）D检测方法，样品经处理后采用液相色谱分离，检测器为串联质谱仪，在多反应监测扫描模式下，实现分子离子和碎片离子2次质量选择，可同时检测25-（OH）D₂和25-（OH）D₃，具有非常高的灵敏度、特异性和准确性，被国际公认为检测的金标准。虽然LC-MS/MS在25-（OH）D检测特异性具有明显的优势，但需要样品量较大，样品前处理复杂耗时长，仪器操作较复杂，对操作人员的要求较高，仪器昂贵，而且需要自己开发方法等，一定程度上限制了LC-MS/MS的临床推广使用。

Tai等采用液-液萃取反相LC-MS/MS法检测已知浓度的25-（OH）D标本，考察和评价方法学。结果显示，25-（OH）D₂和25-（OH）D₃的回收率为99.0%～101.0%，绝对回收率分别为92%和97%。而且，研究显示方法的精度非常高，当25-（OH）D>1ng/g时的CV为0.2%～0.6%；25-（OH）D<1 ng/g时的CV<2%。该方法能够将25-（OH）D₂和25-（OH）D3与其各自的同分异构体分离开。在信噪比约为3时，检测限约为0.15 ng/g。曾义建立LC-MS/MS法测定血清中的25-（0H）D含量，结果显示，25-（OH）D₂和25-（OH）D₃在5～100 ng/ml的质量浓度线性范围与峰面积有良好的线性关系（r²=0.9992，0.9995），回收率在96.19%～108.23%，日内RSD为1.29%～3.71%，日间RSD为4.03%～7.10%，检测限为2 sg/ml。徐凤仙建立LC-MS/MS法测定健康志愿者血清25-（OH）D含量，结果表明，LC-MS/MS法检测血清25-（OH）D：和25-（OH）D，在0.5～10.0 ng/ml、5～100ng/ml范围内线性良好（r²=0.9991，0.9999），批内RSD为0.88%～7.69%，批间RSD为1.56%～9.90%，校准品测试结果正确度为95.5%～101.2%，因此，应用LC-MS/MS检测血清25-（OH）D₂和25-（OH）D，具有良好的准确度和精密度，适合在临床推广使用，同时可以作为标准与其他检测25-（OH）D的方法作比较。

2.3放射免疫法（RIA）

放射免疫法（RIA）是最为经典的测定血清25-（OH）D的方法。目前应用较广泛的试剂盒采用¹²⁵I-25-（OH）D₃作为示踪物，与待测样品中25-（OH）D竞争性结合抗25-（OH）D山羊抗体，用两步抗原抗体反应以实现固液分离，并用Gamma计数器检测沉淀中¹²⁵I的放射量以计算样品中25-（OH）D的浓度。该方法不需要复杂的样品预处理纯化过程，操作简单，解决了HPLC法操作复杂不适于临床检测应用的问题。RIA试剂盒目前应用比较广泛、方便，灵敏度高，特异性强，精密度好，所需要的仪器要求较低，是基层单位对超微量物质测定的主要手段。但是RIA法不能区分检测25-（OH）D₂和25-（OH）D₃，还具有放射性污染的潜在风险，对实验人员和环境都有损害，放射性废物的处理也比较复杂。而且测量需要设立平行样，花费较多，每次检测的数量有限。

多项研究报道，对于血清25-（OH）D的测定，RIA法与LC-MS/MS法测定结果的相关性较好。Van denOuweland等比较了Diasorin RIA法与LC-MS/MS法检测来自国际维生素D室间质评计划（DEQAS）的室间质控标本，同时也分析比较了其他使用LC-MS/MS方法的实验室检测结果，结果发现，RIA法与LC-MS/MS法结果符合度高，相关系数，r²=0.90，平均偏差为1.61nmol/L。Farrell等对170例随机选取的患者标本分别采用RIA法和LC-MS/MS法检测，连续5 d取2份血清重复测量5次，以评估批内及批外的精密度，结果显示，LC-MS/MS法的一致相关性（CCC）为0.99，平均偏差为1.4 nmol/L，RIA法与LC-MS/MS，法相当，其CCC为0.97，平均偏差为2.7 nmol/L。郑晓艳对53例血清样本分别采用RIA法和LC-MS/MS法检测25-（0H）D，结果显示两者相关性良好，相关系数，为0.883。RIA法与金标准LC-MS/MS法检测的相关性好，使用方便，适合于常规临床实验室开展。

2.4酶联免疫吸附法（ELISA）

酶联免疫口及附法（ELISA）是早期维生素D测定的主流方法，是将可溶性的抗原或抗体结合到固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法：ELISA法在自动化操作、节省人力、无污染等方面具有一定的优势，适合于常规临床实验室开展.但是该法只能用于检测25-（OH）D总的含量，当受试者服用维生素D₂时，ELISA法测定会存在偏差，可能造成临床决策的失误，使维生素D中毒风险增大

另外，ELISA法的主要缺陷是对基质敏感，容易与其他非目标化合物发生交叉反应，导致方法特异性不足。而且，酶促反应受反应温度、时间、加样准确性、洗板等因素影响.批内和批间的变异系数相对较大

高玲娟采用ELISA试剂盒检测25-（OH）D水平，对ELISA方法学进行系统评价，结果发现，ELISA测定25-（OH）D的批内CV为2.13%～4.32%，批间CV<5%，定值质控品相对偏差≤8%，拟合曲线相关系数R²≥0.99，最低检出限为5 nmol/L，符合临床使用的要求。毛旭东随机选取50例患者，对同一血清样本分别用ELISA法和LC-MS/MS法测定25-（OH）D₃水平，结果显示，LC-MS/MS法测定的25-（OH）D₃均数为（14.99+6.51）ng/ml，EI=ISA法测定的均数为（20.91±9.70）ng/ml，两者的相关系数为0.725，LC-MS/MS法组25-（OH）D₃浓度高于20 ng/ml的为17%，ELISA法组为52%。LC-MS/MS法测定的25-（OH）D₃数值明显低于ELISA法，两者正相关性较高，可经方程互换，ELISA法低估了体内维生素D的缺乏一尽管ELISA法的缺点较为显著，但在严格控制实验条件下，作为大规模筛查维生素D缺乏及过量的方法，ELISA法具有其他方法不可比拟的优势，目前仍广泛用于临床的体外诊断。

2.5化学发光免疫测定法（CLIA）

化学发光免疫测定试剂盒使用连接有异鲁米诺衍生物的25-（OH）D与样品中25-（OH）D竞争性结合包被了25-（OH）D特异性抗体的磁珠，反应终止后加入激发剂，使用光电倍增管检测产生的化学荧光信号。CLIA法的优点是操作简单、快速，无同位素污染，而且容易自动化，现已有多家厂商开发出相关自动免疫分析仪；缺点是仪器价格高、只能用于检测25-（0H）D总的含量。

单咏梅对LIAISON全自动化学发光仪测定25-（OH）D的检测性能进行验证和评估，实验结果表明线性范围为6～131 ng/ml，批内RSD为5.23%，批间RSD为1.06%，总RSD为6.57%，分析灵敏度为2.5 ng/ml，功能灵敏度为3.0 ng/ml，可以满足临床使用需要，Frenzel等。对比了LIAISON CLIA法与Dia RIA法和LC-MS/MS测定25-（0H）D的结果相关性，CLIA法测定的结果与RIA检测结果的相关系数为0.94，与LC-MS/MS的相关系数为0.95。CLIA测定结果准确性和特异性高，自动化、可控性强，适合大规模维生素D营养状况监测。

2.6电化学发光免疫测定法（ECLIA）

电化学发光免疫测定试剂盒使用生物素标记的25-（OH）D与样品中25-（0H）D竞争性结合钉标记的维生素D结合蛋白（DBP）后，用包被r链霉亲和素的磁珠将生物素标记的25-（0H）D-钌标记的维生素D结合蛋白复合体固定，光电倍增管检测钉的电发光信号强度回算样品中的25-（OH）D浓度。该法具有高灵敏度，且所受影响因素较少，能自动化批量操作÷

何国坚应用罗氏CS E170分析仪采用ECLIA法检测维生素D，结果显示，其线性范围为3～70 ng/ml（r=0.9881，检出限为3.0 ng/ml；2种不同浓度的定值质控血清在准确度评估中相对偏差均<8%；3种不同浓度的临床患者混合血清及2种不同浓度的定值质控血清评估精密度批内、批问CV均<5%，符合临床检测的要求。有学者分析比较了罗氏E170电化学发光免疫分析仪与RIA、HPLC、LC-MS/MS检测25-（OH）D₃结果的符合性，发现ECLIA法与RIA和LC-MS/MS检测结果的一致性较好。所以，ECLIA法检测维生素D的准确度、精密度、线性范围、抗干扰能力等均符合临床检验要求。

2.7全自动生化分析法

全自动生化分析法利用全自动生化仪，根据光电比色原理来测量血液中25-（OH）D的总含量。由于其操作简单、测量速度快、准确性较高、消耗试剂量小，在各级医院得到广泛应用。其缺点是仅能检测25-（OH）D的总含量，精密度和特异性稍差，仪器间的性能差异大，容易造成样品间交叉污染。

目前利用全自动生化法检测维生素D的相关报道较少。宋爱华评估了全自动生化法测定25-（OH）D的方法学，结果显示，该方法的回收率为108%；其空白限为3.5 ng/ml，定量检出限为7.6 ng/ml，检测线性上限可达148 ng/ml；其批内、日间及总CV小于10%，对于病理异常低值样本，其批内、日间及总CV小于15%：而且，与索林CLIA法测定结果的相关系数r=0.9941，因此，全自动生化分析法分析性能良好，操作简便，适合各级医院推广应用。

综上所述，维生素D是儿童生长发育过程中不可缺少的营养物质之一，成人在维持机体代谢和预防疾病方面也不可缺少。测定血清中25-（OH）D的含量是评价人体维生素D营养状况的最佳指标，临床上对25-（OH）D的检测需求越来越大。目前临床常用的方法有免疫分析法和色谱法。各种测定方法都有其优缺点，原理和操作步骤也有所不同，不同方法之间的25-（OH）D检测结果可能出现不同程度的差异，因此，在方法选择时，应根据测定灵敏度、特异性、测定费用、测定时间及实验人员能力和实验室条件等实际情况进行综合考虑。