液相色谱法测定水产品中恩诺沙星残留量的不确定度评定

牛曰华

(福建省海洋环境与渔业资源监测中心，福建 福州 350003)



液相色谱法测定水产品中恩诺沙星残留量的不确定度评定

牛曰华

(福建省海洋环境与渔业资源监测中心，福建 福州 350003)

当水产品中恩诺沙星残留量接近最高残留限量时，为准确判断产品是否符合要求，开展测量不确定度评定便十分重要。基于此，本文建立了液相色谱法测定水产品中恩诺沙星残留量的不确定度分析和评定方法。依据JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》和CNAS—GL06：2006《化学分析中不确定度的评估指南》规定的基本方法和程序，建立恩诺沙星残留量的测量不确定度数学模型，分析不确定度的来源，对主要不确定度分量进行计算和合成，最终得到扩展不确定度。当样品中恩诺沙星测量值为97.1 μg/kg时，其扩展不确定度为5.6 μg/kg。分析结果表明，测定结果的不确定度主要来源于样品前处理和标准溶液。

液相色谱法；水产品；恩诺沙星；不确定度评定

测量不确定度是根据所用到的信息，表征赋予被测量值分散性的非负参数[1]。一个完整的检测结果通常包括测量估计值和其不确定度等有关信息[2]。《检验检测机构资质认定评审准则》对测量不确定度的评定提出了明确要求，主要包括：检验检测机构应制定测量不确定度的评定程序、建立覆盖主要检测类型的测量不确定度评定案例以及在必要时给出测量不确定度。测量不确定度在实验室间结果比对和检测结果的国际互认方面具有重要意义[3]。此外，当检测结果处于产品标准要求的临界值，产品有可能被判定为不合格时，这种情况下应给出测量不确定度[4]。基于此，测量不确定度的评定在检测领域越来越受到重视。

恩诺沙星(Enrofloxacin，EF)是人工合成的第三代氟喹诺酮类(Fluoroquinolones，FQs)抗菌药物，对绝大多数革兰氏阴性菌以及部分革兰氏阳性菌有效[5]，对杀鲑气单胞菌(Aeromonassalmonicida)、杀鲑气弧菌(Vibriosalmonicida)、鳗弧菌(V.anguillarum)和红色耶尔森菌(Yersiniarucheri)等水产动物致病菌高度敏感[6-7]，因此广泛应用于水产养殖业。但不合理的用药也会对人体健康和生态环境带来危害[8]。因此，恩诺沙星是中国申报无公害水产品必须要检测的项目，也是水产品质量安全监管的重要对象。中国农业部第235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》规定水产动物肌肉中恩诺沙星最高残留限量为100 μg/kg。农业部783号公告—2—2006《水产品中诺氟沙星、盐酸环丙沙星、恩诺沙星残留量的测定 液相色谱法》[9]是监测水产品中恩诺沙星残留量常用的检测方法。检测方法的不确定度是判定测量结果准确性的重要依据。当水产品中恩诺沙星残留量检测值接近最高残留限量时，为准确判断产品是否符合要求，对方法开展测量不确定度评定十分必要。因此，本研究根据JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》[10]以及CNAS—GL06：2006《化学分析中不确定度的评估指南》[11]规定的基本方法和程序，对农业部783号公告—2—2006方法的不确定度进行分析和评定，找出影响检测结果的主要不确定度分量。在实际操作中可用于指导检测人员对主要的不确定度分量进行重点控制，以提高检测结果的质量；为从事水产品药残检测和研究的相关人员提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Waters H-CLASS超高效液相色谱仪，配FLR检测器；ALC-210.3电子天平和BP211D电子天平(德国Sartorius公司)；3-30K高速离心机(德国Sigma公司)；LR4000旋转蒸发仪(德国Heidolph公司)；超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)；MS3涡旋混合器(德国IKA公司)；Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)等。

恩诺沙星标准品(德国Dr.Ehrenstorfer公司)；乙腈、正已烷为色谱纯，购于Merck公司；三乙胺、无水硫酸钠为分析纯，购于国药集团有限公司；磷酸，优级纯，购于美国Tedia公司。

1.2 样品前处理方法

参照农业部783号公告—2—2006《水产品中诺氟沙星、盐酸环丙沙星、恩诺沙星残留量的测定 液相色谱法》进行样品前处理。

1.3 标准溶液的配制

标准储备液的配制：准确称取恩诺沙星标准品10.0 mg，用流动相溶解后，定容至100 mL。该标准储备液浓度为100 mg/L。

标准中间液的配制：准确移取5.00 mL标准储备液，用流动相定容至100 mL，得到5 mg/L的标准中间液。

标准工作液的配制：分别移取1.00 mL标准中间液至10、25、50、100、200 mL容量瓶中，用流动相定容，摇匀，得到500、200、100、50、25 μg/L的标准工作液。

1.4 色谱条件

色谱柱为BEH C18柱，规格100 mm×2.1 mm，粒径1.7 μm；流动相A相为0.025 mol/L磷酸(用三乙胺调pH至3.0)，B相为乙腈，A∶B=87∶13(V/V)，流速0.30 mL/min；柱温40℃；进样量2.00 μL；检测波长：激发波长280 nm，发射波长450 nm。

2 测量不确定度的评定

2.1 数学模型

水产品中恩诺沙星残留量的数学模型如式(1)所示。

式(1)

式(1)中，X为样品中恩诺沙星的含量(μg/kg)；m为样品的称取量(g)；v为样品的定容体积(mL)；Cs为标准溶液浓度(μg/L)；As为标准溶液的峰面积；A为样液中恩诺沙星的峰面积；f为回收率校正因子。

2.2 不确定度来源分析

根据数学模型和检测过程分析，水产品中恩诺沙星残留量的不确定度来源主要包括：样品称量、标准溶液、标准曲线拟合、样品定容、样品前处理以及测量仪器。其中，样品称量的不确定度主要来自于天平；标准溶液的不确定度由配制过程中产生，主要由标准物质本身、标准物质的称量以及配制过程中使用玻璃量器等引入；样品定容的不确定度主要来自于移液器；样品前处理的不确定度主要来自样品的提取和净化等操作步骤。

2.3 不确定度分量的计算

2.3.1 样品称量的不确定度

2.3.2 标准溶液的不确定度

标准溶液配制过程产生的不确定度主要由标准物质纯度、标准物质的称量以及标准溶液配制过程中使用的移液管和容量瓶等引入。

1) 标准物质纯度的不确定度

2) 标准物质称量的不确定度

3) 标准溶液配制过程中玻璃量器引入的不确定度

恩诺沙星标准溶液配制过程中使用了经检定为A级的容量瓶和单标线吸量管。使用容量瓶和吸量管引入的不确定度主要包括量器校准产生的不确定度ur(c3，v)和配制标准溶液时的温度与检定标准温度(20℃)不同产生的不确定度ur(c3，t)。

式(2)

式(2)中，V1为量器的标称容量，V2为量器容量最大允许误差。

式(3)

由公式(2)和公式(3)，得到ur(c3，v)和ur(c3，t)，进而得到各量器的相对合成标准不确定度，结果如表1所示。

表1 量器的不确定度

续表1

根据量器的使用次数，得到标准溶液配制过程中使用量器产生的不确定度：

因此，标准溶液引入的不确定度：

2.3.3 标准曲线拟合产生的不确定度

将配制的标准工作液进行上机检测，得到恩诺沙星各浓度的色谱峰面积，如表2所示。

表2 恩诺沙星标准工作液的色谱峰面积

用最小二乘法进行线性拟合，得到恩诺沙星浓度标准曲线，曲线方程为y=6 380x-5 164(其中y表示峰面积，x表示恩诺沙星浓度)，相关系数R2=0.999 9，标准曲线斜率a=6 380，标准曲线截距b=-5 164。标准溶液峰面积残差的标准偏差S用式(4)表示。

式(4)

式(4)中，a、b、n、xi、yi分别代表标准曲线斜率、标准曲线截距、标准溶液总的测量次数(n=5)、第i个标准溶液的浓度(μg/L)和第i个标准溶液的色谱峰面积(μV·s)。

由式(4)得到标准溶液峰面积残差的标准偏差S=7 230。

标准溶液浓度残差的平方和Scc用式(5)表示。

式(5)

由式(5)得到标准溶液浓度残差的平方和Scc=150 000。

对水产品样品中的恩诺沙星进行2次平行检测，得到的峰面积分别为2 910 879 μV·s和3 275 113 μV·s，通过标准曲线查得的样液浓度分别为457.06 μg/L和514.15 μg/L，平均值为485.60 μg/L。

由最小二乘法拟合标准曲线引入的标准不确定度u(q)用式(6)表示。

式(6)

式(6)中，X为样液中恩诺沙星的浓度，X=485.60 μg/L；p为样品测量次数，p=2。

2.3.4 样品定容的不确定度

2.3.5 样品前处理引入的不确定度

样品前处理主要包括酸化乙腈提取、正己烷除脂净化以及浓缩等操作步骤，其产生的不确定度通常用加标回收率进行评定。用阴性草鱼样品做6份平行加标实验，加标浓度为国家规定的最高残留限量浓度100 μg/kg。测定结果如表3所示。

表3 加标回收率结果

设显著水平α=0.05，tα(0.05，5)=2.571。t>tα(0.05，5)=2.571，说明平均回收率与100%差异显著，因此必须考虑方法回收率引入的不确定度。

2.3.6 检测仪器引入的不确定度

2.4 标准不确定度的合成和扩展

2.4.1 合成标准不确定度

根据得到的各不确定度分量，得到总的相对合成标准不确定度：

由样液中恩诺沙星的浓度485.60 μg/L，得到样品中恩诺沙星测量值为97.1 μg/kg。因此样品测定中恩诺沙星合成标准不确定度uc(X)=97.1×0.028 78 μg/kg=2.79 μg/kg。

2.4.2 扩展不确定度

取包含因子k=2，扩展不确定度U=k×uc(X)=2×2.79 μg/kg=5.6 μg/kg。

2.5 不确定度报告

采用农业部783号公告—2—2006《水产品中诺氟沙星、盐酸环丙沙星、恩诺沙星残留量的测定 液相色谱法》，测得水产品中恩诺沙星残留量为X=(97.1±5.6)μg/kg，k=2。

由此结果可以看出，样品中恩诺沙星残留量检测值97.1 μg/kg小于国家规定的最高残留限量100 μg/kg，可以判定为合格产品。但同时由于该检测值已经较为接近最高残留限量，并且该检测值的扩展不确定度为5.6 μg/kg，样品仍可能存在一定的风险，需要进一步加以关注。

2.6 不确定度分量分布

根据上述计算，得到各主要不确定度分量，结果如表4所示。由表4可以看出，对不确定度的贡献：样品前处理>标准溶液>样品定容>检测仪器>标准曲线拟合>样品称量。在这些不确定度分量中，样品前处理对不确定度的贡献在50%以上，标准溶液对不确定度的贡献约占22%，样品称量对不确定度的贡献最小。

表4 不确定度分量分布表

3 结论

当水产品中恩诺沙星残留量接近最高残留限量时，为准确判断产品是否符合要求，开展不确定度评定便十分重要。本研究表明，采用农业部783号公告—2—2006《水产品中诺氟沙星、盐酸环丙沙星、恩诺沙星残留量的测定 液相色谱法》进行水产品中恩诺沙星测定，当样品中恩诺沙星检测值为97.1 μg/kg时，其扩展不确定度为5.6 μg/kg。样品前处理是恩诺沙星测量不确定度的最主要来源，占各不确定度分量总和的50%以上；其次是标准溶液，约占各不确定度分量总和的22%；样品称量、标准曲线拟合、样品定容和检测仪器对不确定度的贡献较小。因此，在检测过程中，应保证实验操作的规范性，增加平行样的检测，加强对标准物质和标准溶液的管理，以及对配制标准溶液所用的玻璃量器定期进行检定校准。

[1]国家质量监督检验检疫总局.JJF 1001—2011通用计量术语及定义[S].北京：中国质检出版社，2012.

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[13]国家质量监督检验检疫总局.JJG 646—2006 移液器[S].北京：中国计量出版社，2007.

Uncertainty evaluation for determination of enrofloxacin residue in aquatic products by liquid chromatography

NIU Yuehua

(Fujian Marine Environment and Fishery Resources Monitoring Center，Fuzhou 350003，China)

When enrofloxacin residue is close to the maximum residue limit in aquatic products，it is very important to carry out evaluation of measurement uncertainty to accurately determine whether the products meet the quality standards.So a method of uncertainty evaluation for the determination of enrofloxacin residue in aquatic products by liquid chromatography was established.According to “Evaluation and Expression of Uncertainty in Measurement”(JJF 1059.1—2012)and “Guidance on Evaluating the Uncertainty in Chemical Analysis”(CNAS—GL06：2006)，a mathematical model was constructed and the uncertainty sources were analyzed，and then the main components of uncertainty were quantified and combined.Finally the expanded uncertainty was achieved.When the measured value of enrofloxacin residue in aquatic products was 97.1 μg/kg，its expanded uncertainty was 5.6 μg/kg.The results showed that the major factors of uncertainty were sample pre-treatment and standard solution.The uncertainties of sample pre-treatment and standard solution accounted for more than 50% and 22% of the total uncertainties，respectively.

liquid chromatography；aquatic products；enrofloxacin；uncertainty evaluation

2016-07-12 作者简介：牛曰华(1981-)，男，工程师，农业推广硕士，研究方向：主要从事水产品中药物残留检测.Tel：0591-87836015.E-mail：yhniu99@126.com

S94

A

1006-5601(2016)05-0402-07

牛曰华.液相色谱法测定水产品中恩诺沙星残留量的不确定度评定[J].渔业研究，2016，38(5)：402-408.