猪细小病毒病血清抗体VP2-ELISA检测方法的建立

周　洁，南文龙，何远清，殷黎静，任　倩，秦立得，陈义平⋆

（1.江苏大学实验动物中心，江苏　镇江　212013；2.中国动物卫生与流行病学中心诊断试剂室，山东　青岛　266032）

猪细小病毒病血清抗体VP2-ELISA检测方法的建立

周洁1,2，南文龙2，何远清1，殷黎静1，任倩1，秦立得2，陈义平2⋆

（1.江苏大学实验动物中心，江苏镇江212013；2.中国动物卫生与流行病学中心诊断试剂室，山东青岛266032）

利用纯化的猪细小病毒VP2蛋白为抗原，建立检测猪细小病毒血清抗体的间接VP2-ELISA。最佳反应条件为：抗原包被浓度300 ng/孔，4℃过夜，待检测血清1∶50稀释。与猪细小病毒病阳性血清呈阳性反应，与猪瘟、猪伪狂犬病、猪繁殖与呼吸综合征、猪日本脑炎和猪圆环病毒病等5种疾病的阳性血清均无交叉反应。批间、批内试验变异系数均小于10%。用该方法与Ceditest PPV猪细小病毒抗体检测试剂盒对102份血清进行平行检测和比较，间接VP2-ELISA的敏感性为93.8%，特异性为81.1%，符合率为89.2%。结果表明，猪细小病毒血清抗体间接VP2-ELISA检测方法具有较高的敏感性和特异性，且重复性好，可用于猪细小病毒感染的血清抗体检测。

猪细小病毒；抗体；VP2-ELISA

猪细小病毒（porcine parvovirus，PPV）可引起猪的繁殖障碍，如发情不正常，久配不孕，或产死胎、畸形胎和木乃伊胎，还能引起仔猪的皮炎、腹泻及关节炎[1]，是造成种猪繁殖障碍疾病的病原之一。猪的繁殖障碍是目前困扰集约化猪场生产的重要问题，为了加强对该病的疫情监测和流行病学调查，有必要建立特异性强、敏感性高的血清学检测方法。PPV的结构蛋白（St ructural Protein 2，VP2）具有良好的免疫原性，可作为理想的血清学检测用抗原[2-3]。

笔者以pET32（a）作为表达载体，所选取的片段，尽可能多地涵盖了VP2的抗原优势区域，目的蛋白以包涵体形式存在，表达量占菌体蛋白的65.2%，与PPV阳性血清发生特异性反应。本研究运用表达的蛋白作为抗原，通过一系列的条件优化，建立了针对VP2抗体的间接ELISA检测方法，可用于猪血清中PPV抗体的检测。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1抗原的制备表达猪细小病毒VP2蛋白的原核表达质粒pET-32a-VP2由中国动物卫生与流行病学中心诊断试剂室构建[4]。经IPTG诱导表达，按照HisBind®Puri f ication Kit说明书纯化蛋白，经NanoDrop®ND-1000分光光度计测定蛋白浓度。

1.1.2血清猪细小病毒病（PPV）阳性血清、伪狂犬病（PRV）阳性血清、猪圆环病毒（PCV）阳性血清、猪瘟（HCV）阳性血清、猪日本脑炎（JEV）阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征（PRRSV）阳性血清、SPF猪血清（以上血清均由中国动物卫生与流行病学中心诊断试剂室提供）。临床血清样品采自国内不同地区猪场的PPV灭活苗免疫猪。

1.1.3主要试剂Ceditest®PPV ELISA Kit为荷兰赛迪诊断公司产品；兔抗猪IgG-HRP和TMB均为Sigma公司（美国）产品；其他常规试剂均为国产分析纯级产品。

1.2方法

1.2.1蛋白含量的测定选择纯化好的抗原，用NanoDrop-1000紫外分光光度计测定蛋白含量，具体方法为：先用2.5μL的纯水对仪器进行初始化，再用2.5μL的蛋白洗脱液即含6 M尿素的1×Elution Buf fer做空白调零，最后取2.5μL纯化好的蛋白进行测定，测得值即为蛋白浓度。

1.2.2重组抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定采用方阵试验进行滴定。取96孔酶标板，将纯化的VP2重组蛋白用pH 9.6碳酸盐缓冲液自上而下依次作1:30、1:62.5、1:125、1:250、1:500、1: 1000、1:2000稀释，100μL/孔；阴阳性血清按1: 12.5、1:25、1:50、1:100、1:200稀释，加兔抗猪酶标二抗，2%牛血清白蛋白溶液（BSA）为封闭液，进行重组抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的优化。加入100μL/孔TMB，37℃显色10 min，最后加入100μL/孔终止液终止反应，测OD450值，根据P/N值确定抗原与血清的最佳稀释度。

1.2.3反应时间的优化采用已优化的抗原包被浓度和血清稀释度，分别改变包被时间、封闭时间、待检血清作用时间、酶标二抗稀释度和作用时间以及底物作用时间，选择最佳反应条件。

1.2.4特异性试验利用已建立的间接ELISA检测方法对PCV、PRV、HCV、JEV和PRRSV阳性血清进行检测。

1.2.5重复性试验

1.2.5.1批内重复试验选取不同OD450值的8份血清样品，用建立的VP2-ELISA进行8次批内重复检测。

1.2.5.2批间重复试验取5份阳性血清样品，3份阴性血清样品，分别用3个不同批次包被的酶标板进行检测。

1.2.6与国外ELISA检测试剂盒的比较将临床送检的102份猪血清样品分别用建立的VP2-ELISA和国外试剂盒进行平行检测，比较建立的检测方法与国外试剂盒检测结果的敏感性、特异性以及符合率。

2　结果与分析

2.1蛋白浓度测定结果经NanoDrop-1000紫外分光光度计测定，测得VP2蛋白浓度为1.53 mg/mL。

2.2重组抗原的诱导表达及纯化如图1。将重组菌进行超声裂解后，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE，结果显示，在约39.1 KDa处有一条很浓的特异性蛋白条带，与预期的融合蛋白大小一致，而未经诱导的pET-VP2转化菌则无此条带，原始pET-32（a）转化菌经IPTG诱导后出现约20.4 KDa的6×His蛋白条带。重组抗原以包涵体形式表达，上清中的蛋白量较少。经His亲和层析柱纯化后，获得了纯化的重组抗原。

图1　表达纯化产物SDS-PAGE分析Fig.1　SDS-PAGE analysis o f the fusion p rotein

表1　VP2抗原和血清最佳稀释度的方阵试验结果Tab le1　Result of the checkerboard titration o f VP2

1:2501:500 1:1000 1:2000 positive negative P/N positive negative P/N positive negative P/N positive negative P/N 1.496 0.256 5.844 0.873 0.174 5.017 0.648 0.316 2.051 0.471 0.273 1.725 1.991 0.167 11.922 0.794 0.160 4.963 0.485 0.118 4.110 0.483 0.140 3.450 0.782 0.110 7.109 0.701 0.070 10.014 0.435 0.065 6.692 0.401 0.053 7.566 0.539 0.050 10.780 0.434 0.050 8.68 0.368 0.037 9.946 0.350 0.028 12.500 0.434 0.025 17.360 0.253 0.040 6.325 0.232 0.025 9.28 0.199 0.019 10.474

2.3抗原与血清最佳稀释度的确定方阵试验结果（表1）可见，当血清和抗原的稀释倍数较低时，OD450值都维持在一个较高的水平，但随着稀释度达到一定程度时，开始产生明显的梯度变化。

综合阴、阳性值、P/N值等方面的因素，初步确定抗原最佳包被浓度为300 ng/孔（即重组抗原以1: 500稀释），待检血清以1:50稀释。

2.4ELISA反应程序通过优化反应条件，建立的ELISA反应程序如下：以pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释抗原至300 ng/孔，每孔包被100μL，37℃作用2 h后，弃去孔内液体，用PBST洗涤3次，每次5 min；用pH 7.4的10%小牛血清/PBST溶液封闭，200μL/孔，37℃封闭2 h，PBST洗板（方法同前）；用pH 7.4的磷酸盐缓冲液作为样品稀释液将待检血清按1:50稀释，以100μL/孔加至各孔，37℃孵育1 h，PBST洗板（方法同前），加入1: 25000稀释的兔抗猪酶标二抗100μL/孔，37℃孵育1 h，PBST洗板（方法同前），加入100μL/孔TMB-过氧化氢尿素溶液，37℃避光显色10 min后，加入100μL/孔2 M H2SO4终止液终止反应，10 min内在酶标仪上读取OD450值。检测时，每块酶标板上设两份阳性血清对照、两份阴性血清对照。计算阳性血清平均值ODP和阴性血清ODN值，阳性血清对照OD450平均值ODP≥0.5，阴性血清对照OD450平均值ODN≤0.2时，试验成立。待检血清样品的OD450≥0.2×ODP+0.8×ODN判为阳性，反之则判为阴性。

2.5特异性试验PCV、PRV、HCV、JEV和PRRSV阳性血清用建立的间接VP2-ELISA方法进行检测，结果均为阴性，表明该方法特异性良好。

2.6重复性试验

2.6.1批内重复性试验选取不同OD450值的8份血清样品，用建立的VP2-ELISA进行8次批内重复检测，结果见表2，变异系数均低于10%，说明该方法具有良好的批内重复性。

2.6.2批间重复性试验用建立的VP2-ELISA，取5份阳性血清样品和3份阴性血清样品分别用3个不同批次包被的酶标板进行检测。3次检测的阴、阳性结果完全一致。5份阳性血清样品的变异系数分别为5.067%、4.582%、7.573%、4.23%和8.641%，3份阴性血清样品的变异系数分别为6.714%、5.793%和7.858%，变异系数均低于10%。表明建立的方法具有良好的批间重复性。

表2　VP2-ELISA批内重复性试验结果Table2　Results of repeat test of VP2-ELISA w ithin a batch

表3　VP2-ELISA与 Ceditest® PPV ELISA检测结果比较Table3　Results of parallel detection by indirect VP2-ELISA and Ceditest® PPV ELISA

2.7VP2-ELISA方法与Ceditest® PPV ELISA Kit检测结果比较将102份猪血清样品分别用建立的间接VP2-ELISA和Ceditest PPV抗体检测试剂盒进行平行检测，结果见表3。

由表3可以看出，Ceditest®PPV ELISA Kit检测为阳性的65份血清样品中间接VP2-ELISA检测出61份阳性；Ceditest®PPV ELISA Kit检测为阴性的37份血清样品中，间接VP2-ELISA检出30份阴性。平行检测的102份血清样品中两种方法检测结果一致的有91份。与Ceditest®PPV ELISA Kit相比，间接VP2-ELISA的敏感性为93.8%，特异性为81.1%，符合率为89.2%。

3　讨论与结论

已报道的PPV诊断方法主要有血凝试验（HA）及血凝抑制试验（HI）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光技术（IFA）、聚合酶链反应（PCR）、核酸探针技术、胶体金标记技术（SECGA）、血清中和试验（SN）、乳胶凝集试验（LAT）和免疫电泳技术等。PPV具有血凝性，应用HA试验检测病原，是较为快速、简单的检测方法[5]，主要用来检测死产和木乃伊胎儿体内的PPV，但该方法敏感性和特异性不太理想。PCR、核酸探针等诊断技术具有特异性好、灵敏度高的优点，近年来开始广泛应用于PPV的病原学检测。HI试验可用于PPV的血清学检测，但该方法所需红细胞为豚鼠红细胞，且待检血清的处理也较为繁琐。ELISA方法特异性好、灵敏度高、快速易行，可实现高通量检测。国内早有PPV全病毒间接ELISA检测方法的研究报道[6-8]，但是全病毒抗原因为纯度问题容易导致不同程度的背景反应，且病毒纯化过程较为繁琐，难以标准化，还存在潜在散毒的危险[9]。用重组蛋白建立间接ELISA可解决这些问题。

PPV基因组有2个主要的开放阅读框，包括3’端结构蛋白（核衣壳蛋白）VP1、VP2、VP3以及5’端非结构蛋白NS1、NS2和NS3。其中VP2蛋白是构成病毒粒子的主要结构蛋白，具有良好的免疫原性，可以诱导机体产生强烈的免疫应答[10]。李昌文等[11]经过分析表明，不同PPV毒株VP2基因的核苷酸之间的同源性为99%左右，含有细小病毒的保守序列。因此，可选用VP2基因作为检测猪群感染PPV血清抗体的抗原。国内已有许多学者[12-14]对VP2基因的表达及ELISA检测方法的建立开展了相关研究，但尚未见与国外商品化PPV ELISA试剂盒检测结果比较的专题报道。本研究所获得的VP2重组蛋白，纯化后产量高，利用其作为检测用抗原进行包被，建立了针对VP2抗体的间接ELISA检测方法，并对反应条件进行了优化。与Ceditest®PPV ELISA Kit检测结果相比，本方法的敏感性、特异性和符合率分别为93.8%（61/65）、81.1%（30/37）和89.2%（91/102），可用于猪细小病毒病血清抗体的检测，为猪细小病毒病的防控发挥积极作用。

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Establishmentof the IndirectELISA for the Detection of Viralstructuralprotein Antibodies againstPorcine Parvovirus

Zhou Jie1,2,Nan Wenlong2,He Yuanqing1,Yin Lij ing1, Ren Qian1,Qin Lide2,Chen Yiping2*
(1.Laboratory Animal Research Center,Jiangsu University,JiangsuZhenj iang212013; 2.Diagnostic Reagent Laboratory,China Animal Heal th and Epidemic Center,ShandongQingdao266032)

In order to detect porcine parvovirus antibodies,an indirect ELISA was establ ished, by using the recombinant VP2 protein as antigen.The reaction conditions of the VP2-ELISA were explored and optimized.The optimal coating concent ration was 300 ng per wel l,the coating condition was at 4℃overnight,and serum samples were di luted to 1:50.The resul ts showed the VP2-ELISA assay was able to detect PPV positive serum,and had no cross-reactivity with serum against HCV,PRV,PRRSV,JEV and PCV,respectively.The int ra and inter-assay coef f icients of variation(CV)of the VP2-ELISA were al l less than 10%.102 swine serum samples were detected by the VP2-ELISA and Ceditest®PPV ELISA Kit in paral lel.The sensitivity and speci ficity of the VP2-ELISA were 93.8%and 81.1%respectively.The coincidence rate between these two assays was 89.2%.The resul ts indicated that the indirect VP2-ELISA was highly sensitive and speci f ic,and could be used for cl inical detection of PPV antibodies.

Porcine Parvovirus;Antibody;VP2-ELISA

S852.65

B

1672-9692(2016)04-0001-07

2016-03-01

周洁（1984-），女，硕士研究生，主要从事诊断试剂研究和实验动物相关工作。

陈义平（1966-），男，博士，研究员，主任，主要从事预防兽医学、诊断试剂研究相关工作。