Gas7在大鼠斜角带核发育过程中的表达

王继胜，侯良芹，熊克仁

（皖南医学院人体解剖学教研室，芜湖 241002）

Gas7在大鼠斜角带核发育过程中的表达

王继胜，侯良芹，熊克仁*

（皖南医学院人体解剖学教研室，芜湖 241002）

目的 研究大鼠发育过程中，生长休止蛋白7（growth arrest-specific protein 7，Gas7）在斜角带核（diagonal band nucleus，DB）的表达。方法 应用RT-PCR方法、Western blot方法和免疫组织化学方法观察胚胎期16.5天（E16.5）、E20.5、出生当天（P0）、生后7天（P7）、P14、P21和2月龄（成年）大鼠DB的Gas7表达及定位。结果 RT-PCR和Western blot检测显示，在E16.5时Gas7表达最弱，其后逐渐增强，至P21时达到高峰；免疫组织化学染色显示，斜角带核水平支（horizontal limb of the diagonal band，HDB）在E16.5和E20.5时出现Gas7免疫反应阳性产物，Gas7阳性神经元出现于P0，至P21时阳性神经元数量最多，染色最深；斜角带核垂直支（vertical limb of the diagonal band，VDB）至P14时Gas7阳性神经元最多，P21和成年均有所减少。结论 Gas7的表达在大鼠DB发育过程中具有时间和空间上的特异性，提示Gas7可能参与大鼠DB的发育过程。

生长休止蛋白7；发育；斜角带核；大鼠

生长休止基因（growth arrest-specific gene，Gas）是近年来发现的在细胞的生长和分化过程中起重要调控作用的一类因子［1］。生长休止基因 7（Gas7）最早发现于体外培养的静止期NIH3T3成纤维细胞，其表达产物Gas7是位于细胞膜附近的一种很强的F-actin结合蛋白，参与细胞骨架的形成［2］。Gas7生物学功能较为复杂，不但参加神经细胞的分化和成熟，还可促进神经细胞轴突的生长，此外还参与到某些神经系统肿瘤的发病过程中［3-5］。Gas7主要表达于中枢神经系统，特异性大量表达于大脑、小脑和海马等处［6-8］。在海马发育过程中，Gas7的表达呈现时空特异性［9］，但在斜角带核（diagonal band nucleus，DB）发育中的表达未见报道。DB作为隔区的功能性核团，其属于边缘系统，与海马、杏仁核和蓝斑等有丰富的纤维联系，参与学习、记忆和认知，并在某些疾病，如阿尔茨海默病，引起的神经系统功能障碍中扮演重要角色［10］。对DB发育过程中的调控因子的研究，有利于丰富DB发育的调控网络，并为与之相关的疾病提供治疗的靶点。

材料和方法

1 实验动物

成年SD大鼠60只，体质量250±20g，雌雄各半，用于繁殖胚胎鼠和生后各发育时期大鼠，由皖南医学院实验动物中心提供。将繁殖的大鼠分为E16.5、E20.5、P0（出生当天）、P7、P14、P21和2月（2M，成年）7组不同时期共126只用于实验。

2 试剂

山羊抗Gas7一抗购自Santa Cruz公司，生物素标记兔抗山羊IgG与HRP-DAB增强型显色剂均购自武汉博士德生物工程有限公司，Trizol-A＋总RNA提取试剂与Qunat cDNA第一链合成试剂盒及PCR试剂盒均购自北京天根生化公司，大鼠Gas7和βactin引物均由上海捷瑞生物科技有限公司合成，D2000 Marker购自南京金斯瑞生物科技有限公司。

3 RT-PCR

取不同时期大鼠DB，按照RNA提取试剂盒说明提取RNA，分装后，取5ul运用凝胶电泳方法检测RNA是否降解，如有2～3条清晰条带，说明RNA未降解可用。用紫外分光光度计测量RNA浓度，并根据在260nm和280nm处的吸光值，检测RNA的纯度。根据RNA浓度，取1μg RNA进行逆转录，构建20μl逆转录反应体系，得 DNA单链（cDNA），-20℃保存。以cDNA为膜板，构建50μl PCR反应体系，分别以5′-AAGAAGAGTCTGGCCGAT-3′和5′-CTCGACTGTGCTTTGGTTGA-3′为Gas7上、下游引物（扩增后Gas7 DNA片段长度为492bp），再分别以5′-CAGGCACCAGGGCGT-3′和 5′-ATGGCTGGGGTGTTGAAG-3′为β-actin上、下游引物（扩增后β-actin DNA片段长度为282bp）。取5μl DNA样本用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，结果用凝胶成像分析系统拍照，测定不同时期大鼠DB的Gas7和β-actin的OD值，取Gas7与βactin的比值为校正值，进行统计学分析。

4 Western-blot方法

按10μl／mg的比例取适当量的裂解液，在使用数分钟前加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mmol／L；将混合液加入研磨器中，在冰上充分研磨，待组织完全裂解后倒入1.5ml EP管中，冰上静置20min；4℃、12000r／min离心10min，取上清液，分装后于-80℃冰箱保存，一部分用于测浓度，一部分用于Western blot检测Gas7水平；按BCA蛋白定量试剂盒说明书的方法测定DB蛋白样本浓度；SDS-Page电泳，浓缩胶90V，分离胶120V；取胶湿转，250mA转膜2h；取膜，5%脱脂牛奶封闭2h，一抗4℃过夜，TBST清洗，二抗室温摇床2h，TBST清洗后，按ECL发光液说明书，暗室曝光，取底片扫描，保存图片，运用凝胶成像分析系统测定蛋白条带光密度，取Gas7蛋白条带光密度值与β-actin光密度值的比值为修正值，进行统计分析。

5 免疫组织化学染色

各时期DB组织浸入4℃的4%多聚甲醛磷酸缓冲液中固定24 h，常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明，石蜡包埋，连续冠状切片，厚5μm，60℃烤片3 h，备染。组织切片常规脱蜡入水，新鲜配制的3% H2O2灭活内源性过氧化物酶，0.02mol／L PBS洗5min×3次；0.01mol／L枸橼酸缓冲液（pH 6.0）微波抗原修复，高火2 min，低火12 min；滴加兔血清封闭液37℃封闭60min；滴加山羊抗Gas7抗体稀释液中（1：100）4℃冰箱过夜，复温，0.02mol／L PBS洗5min×3次，滴加HRP标记的兔抗山羊IgG（1：200），37℃孵育30min，0.02mol／L PBS洗5min×3次；滴加SABC，37℃60 min，0.02mol／L PBS洗5min ×3次；DAB显色5～30min，蒸馏水洗涤；乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察并拍摄照片。每只大鼠取2张切片，利用病理图像分析系统（Hema GSM-2000P，深圳）对每张切片在高倍（10×40倍）视野下测量相同单位面积内Gas7免疫阳性产物的平均灰度值（平均灰度值的大小与染色深浅成反比），同时对轮廓清晰的Gas7免疫阳性细胞进行计数。

结　果

1 发育过程中斜角带核内Gas7表达

RT-PCR检测显示，492bp Gas7条带及282bp βactin条带在DB各时期均清晰可见，且表达稳定。在大鼠DB不同发育时期Gas7 mRNA的表达经βactin校正后发现，在E16.5最低，之后逐渐升高至P21达高峰，2M龄时较P21减弱（图1）。

图1　不同发育时期大鼠斜角带核内Gas7m RNA表达。A，Gas7 mRNA水平RT-PCR检测；B，Gas7 mRNA水平统计学分析；*，与前一时间点比较，P＜0.01Fig.1　Expression of Gas7 mRNA in the DB of rats during different developmental periods.A，RT-PCR detection of Gas7 mRNA；B，statistical analysis of Gas7 mRNA levels；*，P＜0.01，compared with the previous time point

Western blot检测显示，各个时期的DB中均可见38kD Gas7条带和42kD β-actin条带。经β-actin校正后发现，DB中Gas7水平在发育过程中的变化趋势与其mRNA相似，在E16.5表达最低，之后逐渐升高至P21达高峰，2M时较P21减弱（图2）。

图2　不同发育时期大鼠斜角带核内Gas7的表达。A，Gas7水平Western blot检测；B，Gas7水平统计学分析；*，与前一时间点比较，P＜0.01Fig.2　Expression of Gas7 in the DB of rats at different developmental periods.A，Western blot detection of Gas7；B，statistical analysis of Gas7 protein levels；*，P＜0.01，compared with the previous time point

3 发育过程中斜角带核内Gas7空间表达特点

E16.5时，斜角带核水平支（horizontal limb of the diagonal band，HDB）出现蓝色斑片状或絮状物结构，斜角带核垂直支（vertical limb of the diagonal band，VDB）内出现少量神经细胞，无突起，并散在一些蓝色颗粒状结构。E20.5时HDB和VDB均可见神经细胞，但细胞轮廓不清，相比E16.5时，颗粒大小明显增大。P0时，HDB在高倍视野下开始有细胞核出现，染色较深，周围胞质着色相对较浅；VDB未见胞核，可见较多突起，形态不规则。P7时散在分布一些神经细胞和突起，神经细胞境界较清楚，细胞数目明显增多，细胞突起较多；HDB较 VDB内细胞着色稍浅。P14时，细胞体积增大，境界清楚，胞体呈椭圆形或圆形者居多，可见较多的细胞突起，此时VDB灰度值最低，细胞数最多，提示此时VDB内Gas7表达最强烈。P21时HDB和VDB细胞大小均进一步增大，此时HDB染色最深，细胞数最多，提示HDB在这一时间点Gas7表达水平最高。成年时HDB和VDB细胞大小及形态与P21时相比无明显改变。HDB和VDB内Gas7达峰时间点不同，提示Gas7对二者的调控作用可能不同。（图3，表1，表2）

图3　大鼠发育过程中　Gas7在　HDB和VDB表达的免疫组织化学检测；比例尺，25μmFig.3　Immunohistochemical detection of Gas7 expression in HDB and VDB in the development of the rats.Scale bar，25μm

表1　大鼠发育过程中　DB内Gas7免疫反应性变化Table 1　Change of Gas7 immunoreactivity in the DB during rat development

表2　大鼠发育过程中DB内　Gas7免疫阳性平均细胞数变化Table 2　Change of the average number of Gas7 positive cells in the DB during rat development

讨　论

隔区亚细胞核团按位置可分为背内侧、腹外侧、背侧和尾侧四个核群。腹外侧核群主要为外侧隔核（LS，lateral septal nucleus），可影响下丘脑内分泌调节、自主反应和摄食行为；背侧核群主要为终纹床核（BNST，bed nucleus of stria terminals）与神经内分泌和内脏活动有关；尾侧核群分为海马伞核（SFi，septafimbrial nucleus）和三角隔核（TS，triargular septal nuleus）与情绪有关；背内侧核群分为内侧隔核（MS，media septum）和DB，以前连合交叉平面为界，将DB分为后方的HDB和前方的VDB。背、腹侧海马及海马后部均有纤维投射到VDB，且腹海马投射到 VDB的纤维多于背海马到 VDB的投射，同时，VDB背、腹侧部均有纤维投射至背、腹侧海马及海马后部，其投射量占隔-海马通路的1／3，在功能上与学习和记忆有关。此外，杏仁外侧核投射至VDB背、腹侧部及HDB，而杏仁皮质核只投射至VDB；以前曾有学者推测蓝斑有纤维投射至VDB和HDB，后经Font等的实验得到证实［11］。近期实验证明，通过注射RXFP3激活MS／DB（内侧隔核／斜角带核复合体）内的ERK磷酸化，可使大鼠的空间记忆功能受损［12］，而注射丁卡因、东莨菪碱等毒蕈碱药物或持续接触锰等有毒物质时，由于其毒性作用，使MS／DB内的胆碱能神经元受损，大鼠的连续条件反射的精确性下降［13，14］。DB除参与到阿尔茨海默病的病理过程中外［10］，还可通过抑制DB神经细胞的凋亡，有效改善由一型糖尿病引起学习和记忆障碍［15］。因此，研究DB发育过程中新的调控因子，有助于丰富DB发育的调控网络，并为与DB相关的神经系统功能和疾病提供新的改善和治疗靶点。

Gas7首先发现于生长停滞的NIH3T3成纤维细胞内，其不但参与胚胎干细胞的迁移和保护，与细胞早期的分化和形态的形成有关，还能促进神经细胞的发育、分化和成熟，在神经元突起的形成和延伸过程中起重要作用。Gas7与PCH蛋白在基因序列上具有高度相似性，PCH蛋白可协同调节细胞的分裂、肌动蛋白细胞骨架的重构和细胞膜的动力学特性，这种功能的实现，依赖于PCH蛋白中的一个结构，即FCH结构域［16］。同样，Gas7基因序列中也存在FCH结构域［3］，Gas7通过它与细胞骨架成分F-actin结合，进而介导微丝的组装和／或去组装，参与细胞的生长过程，并可促进细胞突起的形成。另有实验表明，Gas7基因敲除的小鼠，微管蛋白的延伸功能受损，提示Gas7是细胞稳定生长的重要因素［17］。本实验免疫组织化学结果显示，HDB和VDB在胚胎期均无典型形态的Gas7阳性细胞，阳性产物呈絮状或斑片状，着色较浅，P0和P7时出现Gas7阳性细胞，染色加深，但无清晰可见的细胞突起，不同于HDB，VDB在P7时细胞数达到最大，P14时着色最深，HDB在P21时细胞数最多，着色最深。胚胎期大鼠DB内有Gas7表达，但并不出现阳性神经元，提示这一时期Gas7并没有作用于神经元，或者可能表达于神经胶质细胞；近期有文献报道适量的Gas7表达可促进神经元的迁移［18］，本实验中，VDB在P7是细胞数最多，在P14时染色最深，提示VDB在P7时可能已完成神经元的迁移，P14时染色进一步加深可能表明此时神经元细胞并未完全成熟，Gas7表达仍然处于峰值。对比HDB中 Gas7的表达，提示Gas7在参与DB的发育过程中，对其内的两个核团的调控有时间上的先后顺序，这种调控时序的不同是否与核团的功能相关，有待进一步研究。

通过RT-PCR和Western blot实验结果显示，Gas7在DB的表达均呈现先升高后降低的趋势，胚胎期Gas7表达较弱，随着时间推移和核团的不断发育，Gas7表达逐渐增强，至P21达到高峰，成年后又有所减弱。围生期（E16.5、E20.5、P0、P7、P14、P21）是DB神经细胞发育和成熟、细胞突起形成和构建的最重要时期，根据本实验结果，DB内神经细胞在围生期已基本成熟。结合Gas7在DB发育过程中的表达，提示Gas7不仅参与了DB神经细胞突起的形成和延伸以及突起的构建和重塑，且对神经细胞的发育和成熟起到一定的调控作用。但围生期以外，成年至老年大鼠的Gas7表达如何，尚待进一步研究。

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Expression of Gas7 in the development of rat diagonal band nucleus

Wang Jisheng,Hou Liangqin,Xiong Keren*
（Department of Anatomy，Wannan Medical College，Wuhu 241002，China)

Objective To investigate the expression of growth arrest-specific protein 7(Gas7)in the diagonal band nucleus (DB)of rats at different developmental stages.Methods RT-PCR,Western blot and the immunohistochemistry were used to study the expression and histological localization of Gas7 protein in the DB of the septal area in rats at seven developmental stages:embryo 16.5-day(E16.5),E20.5,postnatal 0-day(P0),P7,P14,P21,and 2-month-old(adult).Results RT-PCR and Western blot results showed that the expression of Gas7 was the weakest at E16.5,then gradually increased and reached a peak at P21.Gas7 positive staining was observed in the horizontal limb of the diagonal band(HDB)through immunohistochemistry at E16.5 and E20.5；Gas7 positive immunoreactive product appeared at P0,while the positive cells and stain reached peak at P21.The number of Gas7 positive cells in the vertical limb of the diagonal band(VDB)reached maximum at P14,while reduced at P21 and the adult period.Conclusion The expression of Gas7 in the DB of the septal area in rats showed specificity in both time and space,suggesting that Gas7 may be involved in the development of DB in the septal area.

Growth arrest-specific protein 7；development；diagonal band nucleus；rat

Q132.4

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2016.05.006

2016-07-23

2016-10-10

安徽省高校省级自然科学项目（11040606M162）；安徽省名师工作室（2014msgzs 152）；皖南医学院中青年科研基金项目（WK 201618）

王继胜，男（1980年），汉族，助教

（To whom correspondence should be addressed）：xkrn＠sohu.com