薰衣草精油对白念珠菌体外抗菌活性及生物膜的影响

刘璇 邵玉龙 吴泽钰 高凡凡 吴恺琪 刘素辉 陈锋

(新疆医科大学基础医学院，乌鲁木齐 830011)



·论著·

薰衣草精油对白念珠菌体外抗菌活性及生物膜的影响

刘璇 邵玉龙 吴泽钰 高凡凡 吴恺琪 刘素辉 陈锋

(新疆医科大学基础医学院，乌鲁木齐 830011)

目的 研究薰衣草精油对白念珠菌的体外抗菌活性和生物膜的影响，为临床真菌感染的治疗提供实验依据。方法 采用纸片扩散法、连续稀释法测定薰衣草精油对白念珠菌的敏感性、最低抑菌浓度 (MIC)和最低杀菌浓度 (MBC)；采用XTT法检测其抑制白念珠菌生物膜50%细胞活性的浓度 (SMIC50)，镜下观察对生物膜形态的影响。结果 白念珠菌对薰衣草精油高度敏感，薰衣草精油对白念珠菌的MIC为12.5 μL/mL，MBC为25 μL/mL；对生物膜的SMIC50是100 μL/mL，对白念珠菌的菌丝生长有抑制作用。结论 薰衣草精油在体外对白念珠菌有抑菌作用。

白念珠菌；薰衣草精油；最低抑菌浓度；最低杀菌浓度；生物膜

[Chin J Mycol，2016，11(5):272-274]

近20 a来，随着抗肿瘤药物、免疫抑制剂和广谱抗生素的广泛应用，器官移植、骨髓移植等新型诊疗技术的开展，糖尿病、艾滋病患者的增加等原因，医院内条件致病性真菌感染日渐增多。其中白念珠菌占大部分[1]。白念珠菌可感染皮肤、黏膜引起鹅口疮、口角糜烂和阴道炎等疾病。

目前，念珠菌临床耐药菌株逐渐增多，需要寻找新的、有效的抗真菌药物。研究表明精油对多种微生物有抑制作用，且精油对真菌的抑制效果要强于对细菌的抑制效果[2]。由于植物精油来源于植物，而且易挥发，作为外用杀菌药物，具有较好的安全性。文献报道薰衣草精油对多种微生物有抑制作用，但目前尚未见关于薰衣草精油抗白念珠菌作用的报道。本研究拟检测新疆薰衣草精油体外对白念珠菌的抗菌作用及对其生物膜的影响，为精油抗菌药物的开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

药品及菌种 薰衣草精油 (纯度100%)，购自新疆伊帕尔汗香料发展有限公司。白念珠菌标准菌株ATCC10231由新疆医科大学基础医学院形态中心微生物学实验室提供。

试剂 RPMI-1640培养基 (赛默飞世尔公司)，酵母膏蛋白胨葡萄糖 (YPG)培养基和沙氏培养基 (杭州滨和微生物试剂有限公司)、XTT试剂盒 (南京凯基生物公司)。

仪器与设备 96孔微量反应板，酶标仪，倒置显微镜。

1.2 方法

体外抑菌试验 (纸片法) 将白念珠菌接种于YPG液体培养基中，用RPMI-1640培养基稀释，血球计数板计数，再以RPMI-1640培养液调整菌液为1×104～1×106CFU/mL备用。取滤纸，用打孔机打成6 mm直径的圆形小纸片。经高压蒸汽121℃、15 min灭菌后，放在35℃温箱中数天，使完全干燥。在纸片上加入新疆伊帕尔汗薰衣草精油原液，并翻动纸片，使各纸片充分浸透精油。取适量白念珠菌涂布到沙氏培养基上。取充分浸泡过精油的纸片贴到平皿培养基表面。35℃温箱中培养24 h。

最小抑菌浓度 (MIC)的测定 将白念珠菌接种于YPG液体培养基中，用RPMI-1640培养基稀释，血球计数板计数，再以RPMI-1640培养液调整菌液为1×104～1×106CFU/mL备用。将薰衣草精油倍比稀释为100、50、25、12.5、6.25、3.1、1.55、0.78、0.36、0.18 μL/mL。取96孔板，每孔加入100 μL菌液，再加入100 μL相应浓度的精油；并设不加药物的对照孔和两性霉素B对照孔。37℃温箱中培养24 h，肉眼观察结果，以无菌生长的最小药物稀释度作为最小抑菌浓度 (MIC)。

薰衣草精油对白念珠菌生物膜的影响 (XTT试剂盒检测) 将白念珠菌划线接种培养后，挑单个菌落接种于YPG液体培养基中，用RPMI-1640培养基稀释，血球计数板计数，再以RPMI-1640培养液调整菌液为1×103～1×104CFU/mL备用。将100 μL菌悬液接种于96孔细胞培养板中，置37℃恒温培养箱培养2 h后弃去培养液，PBS轻柔洗涤3次，每孔加入100 μL含不同浓度精油的RPMI-1640养基，37℃继续培养24 h。每孔加入20 μL XTT，37℃避光培养4 h。在酶标仪波长450 nm处检测各孔OD值。另设空白对照孔 (只加培养液与XTT溶液)、阳性对照孔 (只加菌液与XTT溶液，不含药物)。

薰衣草精油对白念珠菌生物膜的形态学观察 将100 μL的菌液 (1×106个细胞/mL)接种于96孔板中，分别加入不同浓度的薰衣草精油，37℃培养24 h。倒置显微镜下观察生物膜形态的变化。

2 结 果

2.1 体外抑菌试验

白念珠菌标准菌株对薰衣草精油为高度敏感，抑菌圈直径23.2 mm。表明薰衣草精油对白念珠菌有抗菌作用 (见图1)。

2.2 最低抑菌浓度 (MIC)

薰衣草精油对标准菌株的MIC为12.5 μL/mL，MBC为25 μL/mL。

2.3 薰衣草精油对白念珠菌生物膜的影响

随着薰衣草精油浓度的降低，OD值也逐渐升高，表明薰衣草精油对生物膜中白念珠菌活性有抑制作用，50%抑制率的精油浓度是100 μL/mL。2.4 薰衣草精油对白念珠菌生物膜作用的形态学观察

倒置显微镜下可见阳性对照孔酵母细胞与其出芽延伸所形成的菌丝密集交织，并可沿着菌丝形成团块状聚集。在6.25 μL/mL薰衣草精油作用下白念珠菌菌丝开始减少 (见图2～3)。

图1 薰衣草精油对白念珠菌抑菌活性 图2 未经薰衣草精油处理的生物膜 图3 6.25 μL/mL薰衣草精油处理后的生物膜

Fig.1 Antifungal activity of lavender essential oilinvitroFig.2 Biofilm model without lavender essential oil administration Fig.3 Biofilm treated with 6.25 μL/mL of lavender essential oil

3 讨 论

白念珠菌是临床最常见的条件致病性真菌，在机体免疫功能低下或菌群失调时可引起鹅口疮、阴道炎等疾病。目前临床上治疗念珠菌感染的药物主要是三唑类氟康唑等唑类抗真菌药物。但是越来越多的耐药菌株日渐增多，再加上唑类药物明显的肝脏损伤，也限制了其临床使用。研究表明，在传统中医中精油是常用的一大类芳香药物，由于其来源于植物，易挥发，常采用吸入或涂抹等给药途径，具有较好的安全性。因此，从丰富的精油资源中寻找有效的抗真菌药物，用于临床或与唑类药物联合应用，已引起越来越多的重视。

薰衣草 (lavender)又名欧薄荷，为唇形科薰衣草属LavandulaLinn.植物，原产于地中海沿岸[3]。在法国、中国、俄罗斯等国家均有分布，具有悠久的种植和应用历史。新疆是我国薰衣草主产地。研究证实薰衣草精油有一定的抗真菌活性，其主要成分是芳樟醇、乙酸芳樟酯、桉树脑、薰衣草醇和樟脑等[4]。Lis-Balchin等[5]发现芳香醇是薰衣草精油抗菌的主要成分，它能抑制10种真菌的生长。姜黎等[6]报道新疆薰衣草精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、毛霉、绿色木霉菌和酵母菌均有抑制作用，对真菌的抑制作用强于细菌。本实验结果白念珠菌对薰衣草精油高度敏感，MIC为12.5 μL/mL，MBC为25 μL/mL。

白念珠菌感染常与其生物膜形成有关，而生物膜一旦形成很难清除，因此预防和清除生物膜是临床急待解决的问题。研究表明白念珠菌形成生物膜的能力强于其他念珠菌。白念珠菌生物膜结构表现为基底数层酵母细胞黏附于物体表面，其上方有胞外多聚基质 (extracellular matrix，ECM)覆盖，内有大量菌丝生长。因为受到生物膜的保护，膜内菌能够逃逸机体免疫系统的攻击以及药物的杀伤，且能在体内播散，并表现出高度耐药。本试验采用XTT法检测薰衣草精油对体外白念珠菌生物膜的影响。该方法在不破坏生物膜的条件下能检测出生物膜中菌细胞的活性。结果表明，薰衣草精油对白念珠菌SMIC50为100 μL/mL，表现出明显的抗生物膜功能。

白念珠菌是具有酵母一菌丝二相性的真核微生物，菌丝的出现对其致病性与生物膜的形成均至关重要。本实验发现薰衣草精油能明显抑制白念珠菌菌丝的形成，从形态学上进一步验证了薰衣草精油对白念珠菌生物膜的影响。提示一定浓度的薰衣草精油能通过抑制白念珠菌的菌丝形成进而抑制其生物膜的形成及致病性。

薰衣草在我国新疆资源丰富、产量高，其精油对真菌具有较好的抑制作用，作为中药资源有必要对其进行更深入的抑菌活性实验，为天然抗菌药物的开发提供理论依据。

[1] 赵颖，徐英春.临床常见酵母菌感染及耐药现状[J].中国真菌学杂志，2010，5(1):48-52.

[2] 田玉红，周琪，颇俊华，等.广林九号桉叶精油的抑菌活性研究[J].湖北农业科学,2013,52(21):5193-5196.

[3] Teuscher E,Brinckmann J A,Lindenmaier M P.Medicinal spices:A handbook of culinary herbs,spices,spices mixtures and their essential oils[M].Stuttgart,Germany:Medpharm Scientific Publishers,2006:309-310.

[4] 王玉芹，孙亚军，施献儿.薰衣草精油的化学成分与药理活性[J].国外医药.植物药分册，2004，19(1):5-8.

[5] Lis-BalchinM,HartS.Studies on themode ofaction of the essential oil of lavender[J].Phytother Res，1999，3(6):540.

[6] 姜黎，王向未，江英.薰衣草精油抑制作用的研究[J].农产品加工学刊,2011(4):73-75.

[本文编辑] 王 飞

Invitroantifungal activity of lavender essential oil and its effect on biofilm ofCandidaalbicans

LIU Xuan,SHAO Yu-long,WU Ze-yu,GAO Fan-fan,WU Kai-qi,LIU Su-hui,CHEN Feng

(Basicmedicalcollegeofxinjiangmedicaluniversity,Urumqi,830011)

Objective To study antifungal activity of lavender essential oilinvitroand the effect on biofilm ofCandidaalbicans.Methods Disk diffusion and microdilution were used to determine the susceptibility and minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) ofCandidaalbicansto lavender essential oil.XTT reduction assay was performed to determine the SMIC50 of lavender essential oil toC.albicansbiofilms.The effect of lavender essential oil on morphogenesis ofC.albicansbiofilms was observed by inverted microscopy.Results The standard strain ofCandidaalbicanswas highly sensitive to lavender essential oil.MIC of Lavender essential oil toCandidaalbicanswas 12.5 μL/mL,MBC was 25 μL/mL.SMIC50 of lavender essential oil toC.albicansbiofilms was 100 μL/mL.Lavender essential oil could inhibit the filamentous growth.Conclusion Lvender essential oil had antifungal activity againstCandidaalbicansinvitro.

lavender essential oil;Candidaalbicans;MIC;MBC；biofilm

新疆医科大学大学生创新基金 (CX2014019)

刘璇，女 (汉族)，本科在读.E-mail:1521561423@qq.com

陈锋,E-mail:464230407@qq.com

R 379.4

A

1673-3827(2016)11-0272-03

2016-01-06