RhD和HBsAg双表达载体的构建与表达研究

许纪玲,蔡 杰,陆玉婷,蔡旭兵,杨永林

(南京红十字血液中心,江苏 南京210003)



RhD和HBsAg双表达载体的构建与表达研究

许纪玲,蔡 杰,陆玉婷,蔡旭兵,杨永林*

(南京红十字血液中心,江苏 南京210003)

人类Rh血型系统是临床上最重要的血型系统之一，是人类红细胞血型系统最具有多态性的血型系统。到目前为止已发现了至少49种不同抗原，其中与临床相关的主要抗原为D、C、E、c和e等5种。Rh血型抗原定位于人类1号染色体短臂1p34.3-lp36.1，分别编码2个非糖基化的疏水性跨膜蛋白质RhD和RhCE[1]。RhD和RhCE基因同源性高达96%-97%。其中D抗原具有很强的免疫原性，抗原抗体的不相容能引起溶血性输血反应、新生儿溶血病和自身免疫性溶血性贫血[2,3]，因此RhD基因的研究有着重要的指导意义，将HBsAg和RhD构建在同一载体中，可以通过对HBsAg作为表达检测指标，简易快捷的了解RhD的表达情况。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒和细胞株 大肠杆菌DH5a本实验保留菌种，真核表达载体pIRES购自clontech公司，K562细胞株购自昆明细胞库。血液样本经检测RhD为阳性的献血者。

1.1.2 试剂 DNA限制性内切酶EcoRI、MluI、XbaI、SalI、聚合酶Pfu均购置于Fermentas公司，DNA Ligation Kit (Takara，D6020A)、Takara Agarose Gel DNA Purification Kit(Takara，DV805A)，pMD18-T VectorT (Takara，D101A)均购自大连宝生物有限公司，TIANpure Midi Plasmid Kit(DP107)购自天根生化科技(北京)有限公司，Lipofectamine 2000转染试剂盒(，CAT NO.11668-027)购自美国invitrogen公司，QIAamp DNA Mini Kit(CAT NO.51106)购自德国QIAGEN公司，人抗RhD多克隆抗体及HRP标记羊抗人球蛋白抗体购自武汉博士德有限公司，HBsAg检测试剂合购自英科新创生物有限公司。

1.1.3 引物及测序 根据RhD的基因组DNA选取特异性序列区域，使用online设计软件设计扩增引物，用于扩增RhD的9个外显子，具体序列见表1，并设计用于拼接RhD的外显子的引物，具体序列见表2。根据克隆位点序列，设计克隆用引物，将拼接得到的完整RhD基因序列克隆入pIRES载体中，并在下游克隆位点处克隆入HBsAg序列，具体序列见表3。所有引物及测序均上海生工有限工公合成。

表1 RhD的9个外显子的扩增引物序列

表2 RhD的9个外显子进行两两拼接的特异性拼接引物序列

表3 RhD和HBsAg克隆入pIRES载体中的克隆引物序列

1.2 方法

1.2.1 扩增RhD外显子 取200 ml RhD阳性的全血使用QIAamp DNA Mini kit提取基因组DNA，方法参见试剂使用说明。采用Pfu聚合酶及相应九对特异性扩增引物分别扩增出对应的RhD基因的9个外显子[4]。经电泳鉴定后切胶回收分别克隆入PMD18T中，挑选插入目的片段的菌落送交测序，经NCBI网站比对进一步挑选出外显子序列完全正确的克隆。

1.2.2 拼接全长RhD基因 在9个外显子两端设计重叠互补引物，使得相邻两个外显子带有相互末端的重叠序列。采用重叠延伸拼接法进行两两拼接，最后拼接成为完整的RhD序列。将拼接完成的外显子序列克隆入PMD18T中，挑选插入目的基因的菌落送交测序，挑选出与NCBI基因序列上完全一致的阳性克隆。

1.2.3 pIRES双克隆载体的构建 用pIRES的克隆引物扩增RhD全基因，将扩增得到的目的片段和pIRES载体用EcoRI，MluI限制性DNA内切酶进行双酶切，将双酶切后的目的基因和pIRES载体进行切胶回收后，进行连接，转化，挑选阳性克隆。得到pIRES-RhD的重组质粒，RhD在上游克隆位点上。再用pIRES的克隆引物扩增HBsAg基因，将扩增得到的目的片段和pIRES-RhD载体用XbaI，SalI限制性DNA内切酶进行双酶切，将双酶切后的目的基因和pIRES-RhD载体进行切胶回收后，进行连接，转化，挑选阳性克隆。克隆HBsAg基因到pIRES-RhD的下游克隆位点上，最终得到pIRES-RhD-HBsAg的双表达载体，具体流程图见图1。

1.2.4 pIRES-RhD-HBsAg质粒转染 将K562细胞接种于6孔板中，每孔3 ml的RPMI1640完全培养基，待生长到1×106/ml时即可用于转染[5]，转染前更换新鲜培养基。取14 μg待转质粒溶于150 μl Opti-MEM；取12 μl Lipofectamine 2000稀释于150 μl Opti-MEM。将稀释的质粒和转染试剂1∶1混合后室温放置5 min。6孔板中每孔放入250 μl质粒转染试剂混合物。放置于二氧化碳培养箱中培养2天，收集细胞及培养上清，分别检测HBsAg和RhD抗原的表达。

图1 pIRES-RhD-HBsAg载体构建示意图

1.2.5 RhD抗原及HBsAg的检测 取转染后40小时的细胞，约5×106，离心去上清，PBS洗3次，加入细胞裂解液200 μl，混均，并煮沸5 min，12000 g离心5 min，保留上清用WB检测。转膜后常规BSA封闭1 h，加入抗RhD多克隆抗体(1∶200)，常温孵育1 h，洗膜后加入HRP标记羊抗人球蛋白抗体(1∶10 000)，常温孵育1 h，最后采用化学发光方法曝光。取转染后细胞培养上清检测HBsAg，详细方法参见试剂盒说明书。

2 结果

2.1 RhD9个外显子的扩增片段，电泳结果见图2A，条带大小均正确。RhD片段两两拼接产物电泳见图2B。

2.2 克隆得到的pIRES-RhD-HBsAg双表达载体的双酶切鉴定

限制性内切酶EcoRI、MluI37℃对pIRES-RhD-HBsAg进行双酶切，完全消化后进行电泳，结果见图3A，结果表明插入片段大小正确。同样以限制性内切酶XbaI、SalI37℃对pIRES-RhD-HBsAg进行双酶切，完全消化后进行电泳，结果见图3B，结果表明插入片段大小正确。

A：RhD的9个外显子扩增片段。1-9为RhD的9个外显子扩增片段，M：DL2000；B：RhD的两个相邻的外显子片段拼接为一个长片段。1、2：相邻的两个外显子片段，3：两个外显子片段拼接而成的长片段，M：DL2000。

图2 RhD外显子的扩增与拼接

图A：EcoRI，MluI双酶切电泳图。1、2：两pIRES-RhD-HBsAg克隆，M：DL2000；图B：XbaI、SalI双酶切电泳图。1、2：两pIRES-RhD-HBsAg克隆，M：DL2000

图3 质粒的酶切与鉴定

2.3 RhD及HBsAg检测结果

细胞用于RhD检测，WB结果见图4，条带大小约32 Kd，和RhD分子量大小一致。pIRES-RhD-HBsAg转染后的上清用于HBsAg的ELISA检测，结果表明转染后细胞有效表达并分泌HBsAg，结果见表4。

1、2：均为pIRES-RhD-HBsAg转染细胞，Lane3：pIRES转染细胞

图4 RhDWB检测结果

3 讨论

Rh血型系统的相关基因序列有着高度的同源性。Rh血型抗原活性是由红细胞表面的Rh蛋白和Rh相关糖蛋白组装而成的复合物所决定，它们分别受控于1号染色体上2个紧密连锁的RhD和RhCE基因，以及6号染色体上的RhAG基因，到2007年5月为止，使用基因分型技术检测出的等位基因已超过200个，其中RhCE座位上47个，RhD座位上145个，RhAG座位上13个[5]。

RhD变异体包含3类：弱D，部分D，DEL[6]。虽然这3类变异体的分子机理尚未完全明了，但是主要是由于RhD上的碱基位点发生突变，缺失，外显子的拼接发生错误，以及由于RhD和RhCE基因发生重组产生的，因此能够完整的高保真的扩增得到RhD的基因对于进一步研究RhD的抗原反应有着重要的意义。目前国内相关研究多是克隆RhD的部分功能区域，或者采用反转录的方法从RNA中获取RhD的基因，但是由于Rh系统相关基因的高度同源性并不能扩得完全一致的RhD基因，一般经序列比对只能达到97%-98%的匹配度。以这样的序列进行进一步的研究不能够得到非常可靠可信的结果。

传统方法从富含网织红的骨髓中提取RNA模板，进行扩增。本实验直接从普通红细胞中提取基因组DNA，采用外显子直接扩增后拼接的方法得到完整的RhD序列。实验原料更加容易获得，更适合普通实验室进行操作。

本实验采用pIRES双表达载体构建双基因克隆载体。pIRES能在细胞基因组外扩增并表达目的基因，具有多拷贝、强启动、操作方便等优点，它在体外转染细胞效率较高。具有巨细胞病毒启动子、脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点(internal ribosome entrysite，IRES)，IRES连接两个开放阅读框，其转录产物在翻译时，核糖体能同时进入并开始翻译IRES上游及下游的两个转录子。两种基因可同时表达，表达的蛋白无需经过加工和修饰，具有天然的生物学活性。pIRES-RhD-HBsAg载体可以同时表达两种蛋白，通过检测上清液HBsAg的基因表达请况就可以了解膜蛋白RhD的基因转录情况。在本实验中我们进行了初步的转染实验，用构建的双表达载体转染K562细胞[7]，经转染后通过商品化HBsAg的ELISA检测试剂盒检测上清可以很明确的检测到HBsAg的表达，且检测到RhD抗原的表达。

本研究对RhD全序列进行了克隆表达，尚没有包括RhD基因的其他突变体和剪接体[8]，但是为将来进一步进行RhD不同基因型的研究起到铺垫作用。本实验能够证明RhD的转录表达是成功。但是RhD的抗原活性还和其他一些Rh相关蛋白有着协同作用[9-11]，这些作用尚不明确。这些都将是我们进一步研究和所要解决的问题。

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[2]李翠莹，穆士杰，郑 岩.血型不规则抗体筛选在临床输血中的意义[J].第四军医大学学报，2002,23(24)：2327.

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[6]李翠莹，穆士杰，郑 岩.血型不规则抗体筛选在临床输血中的意义[J].第四军医大学学报，2002,23(24)：2327.

[7]严力行,许先国,朱发明,等.RhD 基因的克隆及其在K562 细胞中的表达[J].中国实验血液学杂志,2005,13(3):492.

[8]许先国,吴俊杰,洪小珍,等.鉴定9个新的RhD基因mRNA可变剪接体[J].遗传,2006,28(10): 1213.

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1007-4287(2016)11-1836-05

2016-02-19)

*通讯作者