杰功对蚯蚓的毒性效应及蛋白质含量的影响

白桂芬，张小燕

（赤峰学院 生命科学学院，内蒙古 赤峰 024000）

杰功对蚯蚓的毒性效应及蛋白质含量的影响

白桂芬，张小燕

（赤峰学院 生命科学学院，内蒙古 赤峰 024000）

本实验以赤峰市周边地区蔬菜大棚蚯蚓为研究对象，研究了杰功对蚯蚓的毒性效应和蛋白质含量的影响.经实验得知：不同浓度的杰功对蚯蚓处理24h和48h，蚯蚓的死亡情况和蛋白质含量的变化均有明显的差异，处理24h时，蚯蚓体内蛋白含量的变化趋势为：先上升后下降，蚯蚓死亡数量较少；处理48h时，其蛋白质含量总体表现为下降的趋势，其死亡数量增多.而且相同浓度杰功对蚯蚓处理24h和48h也存在差异性.

杰功；蚯蚓；蛋白质含量；毒性效应

1 引言

随着现代农业生产的发展，人们为了追求更大物质利益，在农业生产中使用大量的农药和化肥，使中国的农药使用量居世界前列[1].随着农药的大量使用，土壤中聚集了多种有害物质使土壤环境的污染程度日趋严重[2-3]，因而土壤中的动植物受到了一定的毒害作用，尤其是影响了蚯蚓的生存和繁殖.蚯蚓是土壤中重要的环节动物，可以维持土壤肥力、活化土壤中的养分，是生态系统的食物链中传递污染物的桥梁，蚯蚓对土壤中一些污染物有较强的敏感性，可以为土壤质量的退化提供早期预警[4,5,6].而且土壤中许多动物以蚯蚓为食，一旦蚯蚓体内积累了土壤中的有害物质，就会使污染物在食物链中传递和富集，可能威胁到食物链中更高级的生物.目前，土壤环境的质量和污染物毒性的测定已经成为国内外研究的热点，以蚯蚓为载体，研究环境污染的生物效应和对土壤质量的影响[7,8,9].杰功，是一种高效、广谱的拟除虫菊酯类杀虫剂，具有触杀和胃毒作用，以触杀为主，喷洒时不能与碱性物质混用以免分解失效；它属于中等神经毒剂，主要对昆虫具有毒杀、趋避的作用，抑制其神经传导.

蚯蚓是最好的动物性蛋白质饲料，体内富含构成组织细胞的有机大分子蛋白质，蛋白质是生命活动主要承担者；当外界某些理化因素变化时，蛋白质可能发生变性，而且多数蛋白质的变性是不可逆的，生物体的生命活动也受到一定影响.研究表明，生物体内的蛋白质在某种程度上也受农药的影响[10]，农药对蚯蚓体内蛋白质含量的影响可以作为土壤质量状况评价指标之一[11].经过实验，希望可以为赤峰地区土壤环境的安全性检测和农业害虫的生物学防治提供理论依据.

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验动物

蚯蚓来源于赤峰市周边的蔬菜大棚，挑选有明显生殖环带，体重为0.3～0.5g，健康且大小基本一致的蚯蚓用于实验.

2.1.2 实验农药

杰功，为白色水乳型杀虫剂，生产于成都皇牌作物科学有限公司；高效氯氟氰菊酯是杰功的有效成分，分子式为：C23H19ClF3NO3；生产日期：2016年1月20日，登记证号：LS20090432，生产批准证号：HNP51087-A7638，产品执行标准号：Q/66047041 -1.61-2009.

2.1.3 实验器材

玻璃培养皿（直径15cm，高2.5cm），中速滤纸（直径15cm），试剂瓶(250mL)，容量瓶（500mL），烧杯（1L），离心机（DD—5M低速台式离心机），注射器（10mL），分光光度计（UV-9600），玻璃比色皿，电子天平(SL2001N)，量筒（25mL,100mL)，移液枪（1-50uL,5000uL)，离心管（50mL），试管等.

2.1.4 蛋白测定试剂盒

规格：100T/96样，产地：南京建成生物工程研究所.生产批号：20160308；有效期至：2016年09月07日.试剂一：考马斯亮兰贮备液60ml×1瓶，在4℃条件下保存6个月.

试剂二：0.563g/L蛋白标准品0.5ml×1支，在4℃条件下保存1个月.

2.1.5 杰功浓度的设计

参照杰功的说明书用药量（120-150克/公顷，8-10克/亩），设置杰功的浓度范围，做多次预实验进行验证.杰功的浓度范围为：0.002g/L，0.004g/L，0.006g/L，0.008g/L，0.01g/L.

2.2 试验方法

2.2.1 滤纸接触法对蚯蚓急性毒理

清肠：用清水洗净蚯蚓，放入铺有双层滤纸的烧杯中，喷洒适量的水使滤纸完全浸湿，最后用保鲜膜封口、解剖针扎孔，保证蚯蚓可进行正常呼吸，将烧杯置于避光处清肠24h.

注入农药：首先在每个玻璃培养皿中铺三层滤纸，使其恰好遮住皿底，然后用注射器从每个浓度的杰功溶液中分别取10ml，分别均匀注入培养皿中，恰好使滤纸浸透，给每个培养皿做好标记，每个浓度设置3组重复实验，设置1个空白对照组.

放入蚯蚓：将清肠的蚯蚓洗干净，用滤纸吸去体表的水分，每个培养皿放入10条蚯蚓，然后用保鲜膜封口、橡皮筋固定，以防蚯蚓逃逸，最后用解剖针扎孔.

记录与观察:将培养皿置于铺有棉花的试验台上，同时保证室内温度在25℃左右.24h、48h分别观察1次,观察蚯蚓在不同时间段的中毒症状，记录蚯蚓的死亡条数,若对其头部或尾部刺激无反应则视为死亡，48h后结束试验，并分别计算蚯蚓死亡率[12-13].

2.2.2 蛋白质含量的测定

2.2.2.1 蛋白质含量测定依据

当考马斯亮兰显色剂加入蛋白标准液或样品中时，由于蛋白质分子含有一个—NH3+基团，考马斯亮兰染液上的阴离子与蛋白质的—NH3+结合，溶液呈蓝色，通过测定吸光值可计算出蛋白质含量[14].

2.2.2.2蛋白质含量测定方法

研磨：分别取染毒24h、48h后每一个浓度存活的蚯蚓，准确称其质量，按质量（g）：体积(mL)=1：9加入生理盐水进行研磨，制成10%的样液.

离心：以2500r/min，离心10min，取上清液，用生理盐水按1:9的比例稀释成1%的样液，混匀，静置10min.

测定OD值：在595nm处、1cm光径，蒸馏水调零，按试剂盒说明方法依次测定各管吸光值（见表1）.

表1 蛋白质测定操作表

利用公式：

计算蚯蚓体内蛋白质含量

2.2.3 数据处理

将蚯蚓的死亡率和蛋白质含量等数据输入计算机，应用Microsoft Excel、WPS对其进行处理.

3 试验结果

3.1 杰功对蚯蚓的毒性效应

蚯蚓一开始接触经杰功处理的滤纸时，出现抱团现象，身体呈卷曲状态，活动逐渐减弱，部分蚯蚓爬到滤纸下面.处理24h时，触摸蚯蚓可明显感觉到其变柔软，部分体节出现纺锤状的囊包，环带变松弛，接触高浓度杰功的蚯蚓有溶血现象，分泌少量黄色液体，有个别蚯蚓死亡；处理48h观察时，部分蚯蚓生殖环腐烂，身体出现断节现象.通过观察得知，杰功的浓度越大，接触时间越长，蚯蚓的中毒症状愈加明显，死亡数量越多，而无农药的空白组蚯蚓表现正常，基本全部存活.

通过记录和计算（见表2），蚯蚓处理24h后，不含农药的对照组和浓度为0.002g/L组中的蚯蚓全部存活；在0.004g/L～0.01g/L浓度范围内，蚯蚓的死亡数目逐渐增多，部分蚯蚓出现轻微中毒现象.处理48h后，在0.002g/L浓度与对照组中，蚯蚓的死亡率由0%升高到3.3%，几乎无致死效应；在0.004g/L～0.01g/L浓度之间，较多蚯蚓出现死亡现象，中毒症状明显.其中在0.01g/L实验组，24h和48h死亡率分别为10%、53.3%，死亡率达到最大值.

表2 蚯蚓接触杰功的死亡情况

根据表2，横坐标为杰功的浓度，纵坐标为蚯蚓处理24h、48h的死亡率（见图1），得出回归方程：

方程中，D表示蚯蚓死亡率（%），X表示杰功浓度（g/L），R为相关系数，P为显著性水平，n为实验处理数.根据方程得出杰功的LC50为0.01g/L.

图1 蚯蚓毒理24h、48h的死亡率

3.2 杰功对蚯蚓蛋白质的影响

根据表3统计的蛋白质浓度，得出不同浓度杰功对蚯蚓处理24h和48h后蛋白质的变化趋势图（见图2）.

表3 处理蚯蚓24h、48h后体内蛋白质含量

图2 杰功对蚯蚓蛋白质的影响

图2中的数据表明：未接触农药时蚯蚓体内蛋白质含量为0.826g/L，而杰功处理蚯蚓24h、48h后其蛋白质含量发生了不同的变化.处理24h后，蛋白质含量的最大值和最小值分别为0.943g/L和0.818g/L，对应的浓度分别为0.008g/L和0.01g/L，蛋白质含量呈先上升后下降的趋势；处理48h后，杰功浓度为0.008g/L时蛋白质的含量为0.368g/L，是最小值，其峰值出现在浓度0.002g/L时，值为0.595g/L，在杰功最大浓度0.01g/L时，蛋白质含量略有上升，浓度为0.383g/L，蛋白质含量随杰功浓度的增大总体呈下降的趋势.

4 讨论与分析

4.1 杰功对蚯蚓的毒性效应

本实验通过使用滤纸接触法，研究了不同浓度的杰功对蚯蚓的急性毒理作用，同时对杰功毒性的强弱有了进一步的了解，该方法需要蚯蚓与农药直接接触，操作简单.通过实验得知，当蚯蚓死亡率达到53.5% 时，对应的杰功浓度是0.01g/L，接触时间为48h，故杰功对蚯蚓的毒性效应不仅与杰功浓度的大小有关，还与处理时间的长短相关，即杰功浓度越大，处理时间越长，对蚯蚓毒理效应越明显；同时证明蚯蚓对杰功具有一定耐受能力，但是有其耐受限度，如果杰功浓度太大就可能超出蚯蚓的耐受限度，就可能使蚯蚓的死亡率升高.杰功含有5%高效氟氯氰菊酯，通过触杀的方式使蚯蚓中毒，破坏组织和器官的结构，如上所述，接触杰功后蚯蚓表现出不同程度的中毒症状，使其不能正常生存.故在田间使用这种药物时可能会使动物及人类中毒，本实验的数据和结论可以为实际操作提供一些依据.

4.2 杰功对蚯蚓蛋白质的影响

不同浓度的杰功对蚯蚓分别处理24h、48h后，对其蛋白质含量进行了测定（见表3）.测定结果表明，杰功处理蚯蚓24h后其内蛋白含量均发生了增加，除了浓度为0.01g/L时蛋白质含量略低于对照组，而处理48h后体内蛋白质含量均减少了，且低于对照组，可见蚯蚓接触杰功24h与48h对其体内蛋白质含量有不同程度的影响.研究资料表明，当蚯蚓遭到外界某种因素胁迫时，内环境可能出现紊乱，内部结构被破坏，其体内少量蛋白质性质改变，同时在应激状态下产生应激蛋白，因此蚯蚓处理24h时体内总蛋白质含量增加了[15].但是随着杰功浓度的增大和处理时间的延长，蚯蚓体内较多蛋白质变性，而变性的蛋白质结构较松散易被蛋白酶水解，使蛋白质含量下降；另外可能破坏了蚯蚓体内蛋白质的生成来源，从而影响了蛋白质的含量，使得总蛋白质含量降低.故杰功处理蚯蚓48h后，蚯蚓体内蛋白质含量表现出明显的下降趋势.

5 展望

在本实验中，杰功浓度达到0.002g/L时，蚯蚓就出现了死亡现象，且浓度为0.01g/L时蚯蚓死亡数目达到一半.实验中按照杰功的剂量说明配置的浓度可能低于田间使用的浓度，但是杰功对蚯蚓也起到了一定的触杀作用，如果杰功处理蚯蚓的时间相对延长或者杰功浓度适当减小，对蚯蚓及其他的昆虫能否起到较好的触杀作用还有待进一步研究.结果表明，同一浓度的杰功对蚯蚓处理不同时间其毒性效应有显著差异，蛋白质含量也表现不同的变化趋势；不同浓度的杰功对蚯蚓的危害程度不相同，同理其蛋白质含量的变化也不同，这些变化都是动态过程，受外界各种因素的影响，除了受杰功浓度、处理时间的影响外，与温度、湿度等条件也有关系.故随着人们对环境质量的高度重视，农药对蚯蚓的毒理效应及蛋白质影响的研究会有很大的发展前景[16].

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