木质素对蔗渣酶水解的影响

肖芳，覃益民，刘幽燕，2

（1广西大学化学化工学院，广西 南宁 530004；2广西生物炼制重点实验室，广西 南宁 530004）

木质素对蔗渣酶水解的影响

肖芳1，覃益民1，刘幽燕1，2

（1广西大学化学化工学院，广西 南宁 530004；2广西生物炼制重点实验室，广西 南宁 530004）

采用机械活化方法对蔗渣进行处理，研究在原料可及性变化时木质素对蔗渣酶解的影响，用牛血清蛋白（BSA）预先使原料中木质素吸附饱和的方法来测定木质素对酶的吸附情况、用 X-射线衍射和扫描电镜来测定蔗渣结晶结构、表面形态来表征原料可及性，从而分析影响的可能机制。结果表明木质素对蔗渣酶水解的影响与蔗渣可及性有关，原料可及性越高，影响越小。当蔗渣可及性相对较低时，此时木质素影响蔗渣酶水解转化率的两种方式（木质素与纤维素、半纤维素组成的致密结构限制纤维素对酶的可及性及木质素对纤维素酶的无效吸附作用）同时存在。当原料的可及性增加到一定程度后（如机械活化 2h的蔗渣），木质素对纤维素酶的吸附作用几乎消除，木质素对蔗渣酶水解的影响主要表现为对酶的可及性的限制。

生物质；木质素；水解；纤维素可及性；机械活化

由于木质纤维原料是由纤维素、半纤维素和木质素组成的致密复杂的聚合物，且具有很强的抗性，使得木质纤维素的预处理和酶解过程成本仍然很高[1]。而要想通过进一步改善木质纤维素预处理的效率和开发新的酶解技术来降低成本，则要对影响酶水解效率的关键因素有更深入的理解。

在各种影响酶水解效率的因素中，纤维原料中木质素的存在被认为是影响酶水解效率重要因素之一[2-3]，并认为其影响机制主要表现在两方面：一方面木质素与纤维素、半纤维素组成的致密复杂的结构限制原料对酶的可及性，即木质素对纤维原料本身可及性的影响[4-5]；另一方面木质素对纤维素酶的非生产性吸附（non-productive adsorbtion）降低了有效作用的酶量[6-7]。研究表明，这样的影响可通过对木质纤维原料预处理去除木质纤维原料中的木质素来降低或消除[8-9]。但由于木质纤维原料组成和结构复杂，影响酶水解效率因素间存在相互间的牵连，且通常脱木质素方法在改变原料木质素含量的同时，或多或少也会改变原料的可及性。因此，在纤维素水解过程中木质素到底主要是起限制纤维素的可及性作用还是主要起对纤维素酶的非生产性吸附作用仍有待深入研究。近来的研究也发现，当将脱去的木质素重新回加到被完全脱木质素或纯纤维素的纤维原料中时，木质素对纤维素的酶解几乎没有影响。因此认为只要纤维原料中纤维素对酶是可及的时候，木质素存在与否对纤维素酶解几乎没有影响[10-11]。但这样的原料体系与天然木质纤维原料体系在结构上有很大的区别，故研究结果并未真正反映出存在于天然原料中木质素的影响行为。

为了排除由于木质素含量变化带来的对酶水解效率的影响，以便更好研究纤维原料可及性变化时木质素的存在对酶水解效率的影响，本文采用机械活化方法对蔗渣进行处理（经处理的蔗渣组成不变，只是结构改变）以获得不同可及性的纤维原料，考察了在原料可及性变化时木质素对蔗渣酶解的影响。用 BSA预先使原料中木质素吸附饱和的方法（可作为“lignin blockers”）[12]来测定木质素对酶的吸附情况、用X-射线衍射和扫描电镜来测定蔗渣结晶结构、表面形态来表征原料可及性，从而分析影响的可能机制。

1　材料与方法

1.1材料

蔗渣：取去皮甘蔗榨汁后水洗除去可溶性糖，后放入80℃恒温干燥箱干燥至恒重备用。

机械活化蔗渣[13]：在自制高能效搅拌磨的研磨筒中加入磨介质 300mL（堆体积），按实验设计要求，调好转速和恒温水浴温度后，放入一定量蔗渣，达到规定活化时间后取出分球，样品烘干后密封保存。以上所有蔗渣样品均过80目筛。

1.2纤维素酶

商品纤维素酶，Sigma公司生产。

1.3蔗渣酶解实验

在250mL锥形瓶中加入100mg蔗渣[或预先用牛血清蛋白（BSA）处理的蔗渣]、10 FPU/g纤维素的酶量和100mL pH为4.8的缓冲溶液，在温度为50℃，转速为160r/min的恒温振荡水槽中酶解12h、24h、36h、48h、60、72h。反应结束后，收集样品，离心，分析上清液总还原糖产率。所有酶解实验均做三组平行。

1.4分析方法

预处理蔗渣木质素含量测定方法为国家标准（GB/T 2677.8—1994和GB/T 10337—1989），纤维素和半纤维素测定方法参见文献[14]。还原糖测定方法为 DNS法[15]。SEM 分析：扫描电镜型号为S-3400N，扫描电压 20kV，放大倍速 3000。XRD分析采用D/max2500V型X-射线衍射仪，加速电压为30kV，电流为25mA，2θ角为5°～50°；扫描速度为 2°/min。纤维素转换为葡萄糖的转化率及结晶度x的计算见式(1)、式(2)[16]。

式中，I002为002晶面衍射强度最大值；Iam是2θ为18°的衍射强度。

2　结果与讨论

2.1蔗渣酶解实验

图1为机械活化预处理2h的蔗渣酶水解过程曲线。可见经机械活化处理后的蔗渣，木质素虽没有脱去（木质素含量与原蔗渣相同，只是提高了蔗渣的可及性），但蔗渣的酶水解转化率均有明显的提高，蔗渣水解反应60h后转化率基本达到最高值。表明当原料的可及性增加时，即使木质素含量较高的原料不经脱木质素，也能获得较好的酶水解效率。

图1　蔗渣酶解进程

图2　机械活化时间对酶解产糖率的影响

为了探索木质素对蔗渣酶水解的影响与蔗渣可及性的关系，用经不同时间机械活化处理的蔗渣进行酶解实验，结果见图2。

与预期结果一样，图2结果表明机械活化处理后的蔗渣酶解产糖率是随着活化时间（可及性）的增加而提高，表明木质素对蔗渣酶水解的影响与蔗渣可及性有关。当蔗渣活化时间较短时（0～1h），由于蔗渣结构受破坏的程度较低，酶解转化率提高得很慢，如处理1h的蔗渣酶解转化率只由未处理时的12.3%提高到17.7%。当蔗渣经活化时间增长时（1～3h），酶解转化率出现快速提高，当蔗渣活化时间大于2h处理后，酶解转化率达到51.8%的最大值，比经碱法脱木质素后蔗渣的酶解转化率还要高（经测定碱法脱木质素后蔗渣的酶解转化率为49.3%），说明当原料的可及性增加时，即使木质素含量较高的蔗渣原料不经脱木质素也能获得较好的酶水解效率，与文献报道的结果相类似[11,16]。至于为何会出现酶解转化率快速提高现象，推测应是原料结构此时发生了较大的变化，此后的原料可及性分析结果也验证了这一点。

由于经机械活化处理后的蔗渣木质素含不变，由木质素含量变化而引起的原料可及性变化以及对纤维素酶吸附的变化可以排除，因此经机械活化处理后的蔗渣酶解产糖率的提高似乎应只是由于机械活化处理方法使原料的可及性增加从而降低或消除了木质素对纤维原料可及性的限制所致。但从添加BSA的实验结果看情况并非如此。当蔗渣经活化时间较短时（0～1h），尽管添加BSA对蔗渣酶解产糖率的提高率还很高（活化0、0.5h和1.0h的提高率分别为 182%、147%、115%），即木质素对纤维素酶的吸附作用很严重，但吸附作用还是随活化时间（可及性）增加而逐渐降低的。特别是当蔗渣经活化时间较长时（2～3h），添加BSA对蔗渣酶解产糖率的影响已变得不明显（活化2.0h、3.0h的酶解产糖率的提高率分别只有3.4%、2.6%），木质素对纤维素酶的吸附作用几乎消除，这表明经机械活化处理后的蔗渣酶解产糖率的提高不仅仅是由于预处理降低或消除了木质素对纤维原料可及性的限制所致，由于蔗渣可及性的提高而降低了木质素对纤维素酶的吸附作用也是原因之一。

2.2原料可及性分析

纤维原料的可及性与其表面形态及内部结晶程度有关。为了进一步说明预处理后纤维原料的可及性变化，用X射线衍射和扫描电镜对不同预处理的蔗渣样进行了分析。

图3显示了未处理和经过处理后蔗渣的X射线图谱。结果表明，预处理并没有改变蔗渣的晶型，仍然为结晶区和无定形区共存的纤维素Ⅰ类型，2θ＝22.6°的峰对应着结晶区，而2θ＝16°处对应着无定型区[17-19]。但预处理使蔗渣的结晶区和无定形区的比例发生了比较明显的变化。预处理前后蔗渣的结晶度变化采用式(2)进行计算，结果表明蔗渣经过机械活化后，结晶度从48%降低到35.25%，降低了12.75%。

图3　不同预处理后蔗渣的X射线衍射

电镜分析表明（图4），未处理过的蔗渣纤维成束，结构非常紧密，表面很光滑，没有裂纹及孔洞[图4(a)]。而经过机械活化后，蔗渣的表面结构由于在机械活化过程中不断与球体摩擦、冲击、碰撞、剪切而受到破坏，首先纤维束沿着排列方向发生了断裂，表面也出现很多片状剥离及孔洞[图 4(b)]。活化2h后[图4(c)]蔗渣的结构发生了巨大的变化，紧密的纤维束结构消失，并形成了许多细小的颗粒，使蔗渣纤维的比表面积大幅度增加，结果使蔗对纤维酶的可及性也大大增加，从而导致蔗渣酶水解变得容易。这也解释了2.1节中当蔗渣处理时间在1～2h变化时酶解转化率变化有一个明显突跃的原因。

图4　处理前后蔗渣扫描电镜图片

3　结 论

木质素对蔗渣酶水解的影响与蔗渣可及性如表面形态和结晶性有关，原料可及性越高，影响越小。当蔗渣可及性相对较低时，木质素影响蔗渣酶水解转化率的两种方式（木质素对纤维素酶的吸附作用及木质素与纤维素、半纤维素组成的致密的结构限制纤维素对酶的可及性）同时存在。当预处理方法使原料的可及性增加到一定程度后（如机械活化2h的蔗渣），此时木质素对纤维素酶的吸附作用几乎消除，木质素对蔗渣酶水解的影响主要表现为对酶的可及性的限制。

[1] LYND L R，LASER M S，BRANSBY D，et al. How biotech can transform biofuels[J]. Nature Biotechnology，2008，26：169-172.

[2] STUDER M H，DEMARTINI J D，DAVIS M F，et al. Lignin content in natural populus variants affects sugar release[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences （PNAS），2011，108（15）：6300-6305.

[3] YU Z，JAMEEL H，CHANG H，et al. The effect of delignification of forest biomass on enzymatic hydrolysis [J]. Bioresource Technology，2011，102（19）：9083-9089.

[4] SI S，CHEN Y，FAN C，et al. Lignin extraction distinctively enhances biomassenzymaticsaccharificationinhemicelluloses-rich Miscanthus species under various alkali and acid pretreatments [J]. Bioresource Technology，2015，183：248-254.

[5] MENG X Z，RAGAUSKAS A J. Recent advances in understanding the role of cellulose accessibility in enzymatic hydrolysis of lignocellulosic substrates[J]. Current Opinion in Biotechnology，2014，27：150-158.

[6] NAKAGAME S，CHANDRA R P，KADLA J F，et al. Enhancing the enzymatic hydrolysis of lignocellulosic biomass by increasing the carboxylic acid content of the associated lignin [J]. Biotechnology and Bioengineering，2011，108：538-548.

[7] KO J K，XIMENES E，KIM Y，et al. Adsorption of enzyme onto lignins of liquid hot water pretreated hardwoods [J]. Biotechnology and Bioengineering，2015，112：447 -456.

[8] ZHAO X B，PENG F，CHENG K K，et al. Enhancement of the enzymatic digestibility of sugarcane bagasse by alkali-peracetic acid pretreatment[J]. Enzyme and Microbial Technology，2009，44：17-23.

[9] ZHAO X B，ZHANG L H，LIU D H. Comparative study on chemical pretreatment methods for improving enzymatic digestibility of crofton weed stem[J]. Bioresource Technology，2008，99：3729-3736.

[10] BARSBERG S，SELIG M J，CLAUS F. Impact of lignins isolated frompretreatedlignocellulosesonenzymaticcellulose saccharification[J]. Biotechnology Letters，2013，35：189-195.

[11] KUMAR L，ARANTES V，CHANDRA R，et al. The lignin present in steam pretreated softwood binds enzymes and limits cellulose accessibility[J]. Bioresource Technology，2012，103：201-208.

[12] YANG B，WYMAN C E. BSA treatment to enhance enzymatic hydrolysis of cellulose in lignin containing substrates [J]. Biotechnology and Bioengineering，2006，94（4）：611-617.

[13] ZHANG Y J，LI Q，SU J M，et al. A green and efficient technology for the degradation of cellulosic materials：structure changes and enhanced enzymatic hydrolysis of natural cellulose pretreated by synergistic interaction of mechanical activation and metal salt[J]. Bioresource Technology，2015，177：176-181.

[14] 杨胜. 饲料分析及饲料质量检测技术[M]. 北京：北京农业大学出版社，1993：58-63.

[15] MILLER G. Use of dinitrosalicylic acid reagent for the determination of reducing sugars[J]. Analytical Chemistry，1959，31：426-429.

[16] ROLLIN J A，ZHU Z G，SATHITSUKSANOH N，et al. Increasing cellulose accessibility is more important than removing lignin：a comparison of cellulose solvent-based lignocellulose fractionation and soaking in aqueous ammonia[J]. Biotechnology and Bioengineering，2011，108（1）：22-30.

[17] 吴苗苗. 蔗渣组成、结构对酶解产糖率的影响[D]. 广西： 广西大学，2011.

[18] ZHANG Y H，LYND L R. Toward an aggregated understanding of enzymatic hydrolysis of cellulose：noncomplexed cellulase systems [J]. Biotechnology and Bioengineering，2004，88：797-824.

[19] 詹怀宇. 纤维素化学与物理[M]. 北京：科学出版社，2005： 82-126.

The effect of lignin in bagasse enzyme hydrolysis

XIAO Fang1，QIN Yimin1，LIU Youyan1，2
（1School of Chemistry and Chemical Engineering ，Guangxi University，Nanning 530004，Guangxi，China；2Guangxi Key Laboratory of Biorefinery，Nanning 530004，Guangxi，China）

The mechanical activation method was employed to process bagasse. The effect of lignin on enzymatic hydrolysis was studied effect when the raw material accessibility changed. The X-ray diffraction and scanning electron microscopy（SEM）were used to determine the crystal structure and surface morphology of bagasse，to characterize the raw material accessibility，and analyze the influence of the possible mechanisms. The results showed that the effect of lignin on bagasse enzyme hydrolysis was related to bagasse accessibility. The higher raw material availability was，the smaller the effect was. When the accessibility of bagasse was relatively low，lignin affected the rate of enzymatic hydrolysis of bagasse in two ways (limiting cellulose accessibility and unproductive binding of the enzymes) simultaneously. When the availability of raw material increased to a certain level (for example，2 hours by mechanical activation of bagasse) and lignin adsorption of cellulose was virtually eliminated. The main effect of Lignin on bagasse enzymatic hydrolysis was limiting enzyme accessibility.

biomass；lignin；hydrolysis；cellulose accessibility；mechanical activation

TQ 353.4+23

A

1000–6613（2016）12–4072–04

10.16085/j.issn.1000-6613.2016.12.047

2016-05-09；修改稿日期：2016-05-24。

国家自然科学基金（21276053）及广西生物炼制重点实验室培育基地开放课题项目。

肖芳（1989—），女，硕士研究生。E-mail quitefang@sina.com。

联系人：覃益民，博士，教授。E-mail qym6289@sina.com。