褪黑素对急性脊髓损伤大鼠脊髓组织中MPO及CINC-1表达的影响*

苗金红，朱海洋，钟 斌，崔 浩，汪 鑫，理 阳，徐玉生#

1)郑州大学第一附属医院 郑州 450052 2)郑州大学第一附属医院骨科 郑州 450052



褪黑素对急性脊髓损伤大鼠脊髓组织中MPO及CINC-1表达的影响*

苗金红1)，朱海洋2)，钟 斌2)，崔 浩2)，汪 鑫2)，理 阳2)，徐玉生2)#

1)郑州大学第一附属医院 郑州 450052 2)郑州大学第一附属医院骨科 郑州 450052

#通信作者，男，1969 年 3 月生，博士，主任医师，研究方向:骨科疾病的基础与临床，E-mail:ysxu@zzu.edu.cn

褪黑素：脊髓损伤：中性粒细胞趋化因子；髓过氧化物酶；大鼠

目的：探讨褪黑素(MT)对大鼠急性脊髓损伤后髓过氧化物酶(MPO)及中性粒细胞趋化因子(CINC)-1表达的影响。方法：108只SD大鼠分为假手术组、脊髓损伤组、褪黑素治疗组。手术组大鼠仅切除T11椎板，脊髓损伤组、褪黑素治疗组建立T11脊髓损伤模型。脊髓损伤组、褪黑素治疗组在脊髓损伤后10 min内分别腹腔注射含体积分数5%乙醇的生理盐水和100 mg/kg的褪黑素制剂。于脊髓损伤后1 h、6 h、12 h、1 d、3 d、5 d分别取脊髓组织，化学法测定MPO活力变化，HE染色法观察脊髓组织结构，RT-PCR法观察CINC-1 mRNA表达情况。结果：脊髓内CINC-1水平和MPO活性有相似的变化规律, 且MPO在CINC-1表达达峰之后12 h达高峰；除1 h外各时间点各组相比较，B组最高、C组次之、A组最低，其中B组与A组、C组差异具有统计学意义(P<0.05)。结论：褪黑素可通过抑制CINC-1的表达减少中性粒细胞的浸润，从而减轻炎症反应，起到一定的神经保护作用。

据报道[1-3]全球每年因脊髓损伤导致自主运动及感觉功能损害的患者在1 150万至5 340万之间，且患者生活质量与脊髓损伤程度密切相关。脊髓损伤目前尚无有效的治疗手段。脊髓损伤后继发性引起的炎症反应严重影响着脊髓修复[4-5]，其中中性粒细胞发挥着重要作用[6]。而髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)是中性粒细胞活化的标志物，且中性粒细胞趋化因子-1(cytokine-induced neutrophil chemoattractant,CINC-1)的浓度梯度是中性粒细胞跨越血管内皮的基础。褪黑素(melatonin,MT)是于1956年被Lerner和其同事从牛松果体组织中提取出来的两性分子。有证据[7-10]表明褪黑素具有神经保护、减少氧化应激、减轻水肿等作用。但其是否可通过减少CINC-1的含量从而减轻炎症反应目前尚未见报道。该研究旨在通过脊髓损伤后立即注射褪黑素制剂，观察短期内脊髓组织中CINC-1、MPO的变化，探讨褪黑素在局部炎症反应中的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年雌性SPF级SD大鼠108只，体重(230±20) g，购于河南省实验动物中心，许可证号：SCXK(豫)2010-0002。实验动物自由饮水、随意进食，12 h照明，实验过程中对动物的操作均按照动物伦理学的要求进行。

1.2 主要试剂及仪器 Trizol试剂、Maker、RT试剂盒、PCR试剂盒均购自Transgene公司；引物购自北京博大泰克公司；MPO测试盒购自南京建成公司；MT、DEPC、EB购自美国Sigma公司。PCR GeneAmp System(美国Applied Biosystems公司)；低温离心机(美国Sigma公司)；图像记录分析系统(大连Jim-X Scientific)。

1.3 脊髓损伤动物模型的建立 用体积分数10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠后，术区备皮，取俯卧位固定于手术台上。消毒、铺巾，取背中段正中切口，以T11为中心显露T10～T12棘突、椎板，暴露脊髓硬膜。采用改良Allen’s WD法，自距硬膜15 cm的高度用5 g的砝码垂直落下，建立大鼠脊髓损伤模型。观察到砝码砸伤后硬膜表面出现充血水肿，双下肢出现扑动且为回缩性，尾巴出现摆动且为痉挛性即为造模成功。术毕大量生理盐水冲洗手术视野，适量青霉素钠置于切口内预防感染，再次消毒后缝合切口。

1.4 实验分组 108 只SD健康成年雌性大鼠随机分为假手术组、脊髓损伤组、褪黑素治疗组，每组36只。脊髓损伤组在脊髓损伤后10 min按体重腹腔注射含体积分数5%乙醇的生理盐水(MT溶剂)。褪黑素治疗组给予100 mg/kg[11-12]的褪黑素制剂。假手术组仅行椎板切除而不损伤脊髓。为预防感染，每组大鼠均每日给予腹腔注射青霉素40万单位。脊髓损伤组及褪黑素治疗组术后每天给予人工辅助排尿排便4次。

1.5 HE染色检测脊髓组织形态学变化 各组大鼠于术后1 h、6 h、12 h、1 d、3 d、5 d六个时间点再次麻醉后迅速开胸，用无菌冰生理盐水500 mL心脏灌注，完整地切取T10～T12的脊髓组织。切取T10～T12头端脊髓组织存放在液氮中，待行MPO活性测定及总RNA提取；切取T10～T12尾端脊髓组织浸入体积分数10%中性甲醛固定 24 h，常规酒精脱水，石蜡包埋，用LE ICACM 1900恒冷箱切片机对脊髓组织作横切面连续切片，切片厚度6 μm，放于温水中，载玻片收集组织后，恒温烘箱烘干进行HE染色。

1.6 脊髓组织中CINC-1 mRNA表达水平检测 采用 RT-PCR 扩增法。取冻存脊髓标本于研钵内研碎后采用Trizol法提取总 RNA，然后按逆转录试剂盒说明书逆转录为 cDNA，再以 GAPDH 为内参进行 PCR 扩增。大鼠CINC-1引物序列：上游5’-ATT AGCCTACTGGTGGTGC-3’ ，下游5’-ACAGCCTGGC CTAAGTGA-3’,扩增产物大小为286 bp。大鼠GAPDH引物序列：上游5’-CACGGCAAGTTCAACGGCA CA-3’，下游5’-GCGGCATGTCAGATCCACAACG-3’，扩增产物大小为588 bp。取 5 μL 扩增产物进行凝胶电泳并观察电泳条带，记录图像后进行分析，目的基因CINC-1 mRNA的表达量用CINC-1和GAPDH条带的灰度值比值表示。

1.7 MPO活力测定 应用化学方法，严格按照髓过氧化物酶测试盒说明书测定。

1.8 统计学处理 采用SPSS 21.0进行分析。术后不同时间点各组大鼠脊髓组织CINC-1 mRNA表达和MPO活力的比较采用重复测量数据的方差分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 脊髓损伤建模情况 脊髓损伤组及褪黑素治疗组均出现尿潴留、后肢瘫痪。术后各组大鼠进食水量、活动量明显减少。各组大鼠切口均未出现感染情况。

2.2 各组脊髓组织中CINC-1 mRNA的表达 各组各时间点均出现286 bp 左右的特异性扩增条带，电泳结果见图1～3。各组脊髓组织中CINC-1 mRNA表达的比较见表1。脊髓损伤后12 h 各组大鼠脊髓中CINC-1 mRNA表达水平从高到低依次为脊髓损伤组、褪黑素治疗组、假手术组(图4)。脊髓损伤组及褪黑素治疗组各个时间点CINC-1 mRNA的表达均高于假手术组，但褪黑素治疗组上升程度小于脊髓损伤组。

M：Marker；1、2、3、4、5、6:分别为1 h、6 h、12 h、1 d、3 d和5 d。图1 假手术组不同时间点 脊髓组织CINC-1 mRNA的RT-PCR结果

M：Marker；1、2、3、4、5、6:分别为1 h、6 h、12 h、1 d、3 d和5 d。图2 脊髓损伤组不同时间点 脊髓组织CINC-1 mRNA的RT-PCR结果

M：Marker；1、2、3、4、5、6:分别为1 h、6 h、12 h、1 d、3 d和5 d。图3 褪黑素治疗组不同 时间点脊髓组织CINC-1 mRNA的RT-PCR结果

M：Marker；1、2、3:分别为假手术组、脊髓损伤组、褪黑素治疗组。图4 脊髓损伤后12 h各组大鼠 脊髓组织CINC-1 mRNA的RT-PCR结果表1 术后不同时间点各组大鼠脊髓组织CINC-1 mRNA的表达(n=6)

组别1h6h12h24h3d5d假手术组0.094±0.0040.091±0.0050.100±0.0130.092±0.0110.094±0.0090.094±0.008脊髓损伤组0.110±0.0040.177±0.006*0.850±0.041*0.572±0.025*0.319±0.019*0.154±0.010*褪黑素治疗组0.098±0.0050.148±0.008*#0.545±0.039*#0.404±0.036*#0.208±0.016*#0.127±0.012*#

F组间=16.351，P<0.001；F时间=21.321，P<0.001；F交互=83.217，P<0.001；*：与假手术组比较，P<0.05；#：与脊髓损伤组比较，P<0.05。

2.3 各组大鼠脊髓组织MPO活力比较 结果见表2。

表2 术后不同时间点各组大鼠脊髓组织MPO 活力比较(n=6)

F组间=173.615，P<0.001；F时间=21.321，P<0.001；F交互=18.151，P<0.001；*：与假手术组比较，P<0.05；#：与脊髓损伤组比较，P<0.05。

2.4 各组脊髓组织HE染色结果 见图5。脊髓损伤组和褪黑素治疗组脊髓组织中可见中性粒细胞浸润、组织内结构紊乱等变化，褪黑素治疗组上述变化较脊髓损伤组轻。假手术组脊髓结构无中性粒细胞浸润、出血等变化。

A、B、C:分别为假手术组、脊髓损伤组、褪黑素治疗组。图5 各组大鼠脊髓组织HE染色结果(×400)

3 讨论

褪黑素作为人体内重要的神经内分泌活性物质，对生物的衰老、氧化应激、昼夜节律、肿瘤、性成熟及生殖、免疫反应等均有调节作用。作者前期的实验证实在急性脊髓损伤后给予100 mg/kg的褪黑素可明显抑制脂质过氧化反应、提高神经生长因子表达等作用[13-14]。

CINC-1与人类IL-8功能及结构相近，是人类IL-8的对应物。它不仅能特异性介导中性粒细胞跨越血管内皮，还能诱导细胞膜表面表达黏附分子DC11b/CD18，使中性粒细胞结合内皮细胞的能力增加[15]。而中性粒细胞的聚集、浸润是炎性反应发生的关键步骤。中性粒细胞能够活化和释放氧化物增加内皮黏附分子的表达，其中的弹性蛋白酶能增加血管通透性并能损害内皮细胞完整性进而影响脊髓损伤的发展进程[16-17]。该实验检测了各组各个时间点CINC-1的表达情况，发现CINC-1在脊髓未受损伤的假手术组中均有少量表达且表达量在各个时间点无明显变化。脊髓损伤组CINC-1表达在各个时间点均有明显的增高，且在12 h达高峰，提示可能CINC-1参与了继发性脊髓损伤的过程。而褪黑素治疗组在脊髓损伤后6 h、12 h、1 d、3 d CINC-1 mRNA的表达均低于相同时间点的脊髓损伤组，提示在脊髓损伤后应用褪黑素可抑制CINC-1的表达。

中性粒细胞中存在大量的 MPO。它与中性粒细胞的绝对数量相关联，是一个定量中性粒细胞对损伤组织浸润的特异和敏感标记。该研究用化学方法检测了MPO在假手术组、脊髓损伤组及褪黑素治疗组中的变化情况，发现在假手术组中能检测出低活力的MPO，但随着时间变化MPO活力无明显变化。在脊髓损伤组，损伤区脊髓组织内MPO活力明显升高，伤后1 d达高峰。随着观察时间的延长，MPO活力逐渐减弱，但至脊髓损伤后5 d仍维持较高水平。褪黑素治疗组与脊髓损伤组有相同的变化规律，且褪黑素治疗组在脊髓损伤后 6 h、12 h、1 d、3 d MPO活力明显低于脊髓损伤组。该研究结果表明MPO与CINC-1有相似的表达规律，MPO活力在CINC-1表达达高峰之后12 h也达峰值。

综上所述，作者认为CINC可能通过介导中性粒细胞浸润而参与继发性脊髓损伤过程，而且在急性脊髓损伤后给予褪黑素，会通过抑制CINC-1的表达减少中性粒细胞对损伤脊髓的浸润，从而减轻炎症反应，起到一定的神经保护作用。

[1]NAKANISHI K,TANAKA N,KAMEI N,et al.Resection of spinous processes can cause spinal cord injury in patient with ossification of the posterior longitudinal ligament in the thoracic spine[J].Spinal Cord,2014,52(Suppl 3):S19

[2]WANG B,ZHU Q,MAN X,et al.Ginsenoside Rd inhibits apoptosis following spinal cord ischemia/reperfusion injury[J].Neural Regen Res,2014,9(18):1678

[3]LI C,CHEN X,QIAO S,et al.Melatonin lowers edema after spinal cord injury[J].Neural Regen Res,2014,9(24):2205

[4]潘峰,程艳香,范里,等.他克莫司抑制脂质过氧化对大鼠脊髓的保护效应观察[J].解放军医学杂志,2013,38(4):279

[5]岳妍,谭波涛,刘媛,等.FTY720对急性脊髓损伤大鼠神经功能及血脊髓屏障的影响[J].解放军医学杂志,2015,40(3):200

[6]王连仲,尹忠民,闻华.自体骨髓干细胞联合脐血单个核细胞移植治疗胸段慢性脊髓损伤27例报告[J].解放军医学杂志,2012,37(8):788

[7]SCHIAVETO-DE-SOUZA A,DA-SILVA CA,DEFINO HL,et al.Effect of melatonin on the functional recovery from experimental traumatic compression of the spinal cord[J].Braz J Med Biol Res,2013,46(4):348

[8]MAO L,WANG H,QIAO L,et al.Disruption of Nrf2 enhances the upregulation of nuclear factor-kappaB activity, tumor necrosis factor-α, and matrix metalloproteinase-9 after spinal cord injury in mice[J].Mediators Inflamm,2010(2010):238321

[9]RITZ MF,HAUSMANN ON.Effect of 17beta-estradiol on functional outcome, release of cytokines, astrocyte reactivity and inflammatory spreading after spinal cord injury in male rats[J].Brain Res,2008,1203(4):177

[10]SONG Y,LIU J,ZHANG F,et al.Antioxidant effect of quercetin against acute spinal cord injury in rats and its correlation with the p38MAPK/iNOS signaling pathway[J].Life Sci,2013,92(24/26):1215

[11]LI C,CHEN X,QIAO S,et al.Melatonin lowers edema after spinal cord injury[J].Neural Regen Res,2014,9(24):2205

[12]胡爱民,张治国,侯志贞,等.褪黑素对大鼠实验性脊髓损伤的神经保护作用[J].解放军医学杂志,2011,36(2):164

[13]徐玉生,马玉斐,李星晨,等.褪黑素对脊髓损伤早期大鼠神经生长因子表达的影响[J].郑州大学学报(医学版),2012,47(3):326

[14]徐玉生,李星晨,金伟林,等.褪黑素对急性脊髓损伤大鼠炎症反应的影响[J].中华物理医学与康复杂志,2014,36(4):260

[15]陈宣维,贾连顺,孙海燕,等.大鼠脊髓损伤后中性粒细胞趋化因子基因表达的变化[J].中国临床康复,2004,8(5):890

[16]CAMPAGNOLO DI,BARTLETT JA,KELLER SE.Influence of neurological level on immune function following spinal cord injury: a review[J].J Spinal Cord Med,2000,23(2):121

[17]刘颖,梅伟群,李志琛,等.褪黑素对胰岛素抵抗大鼠皮下脂肪组织瘦素表达的作用观察[J].解放军医学杂志,2014,39(1):15

(2016-01-22收稿 责任编辑李沛寰)

Effects of melatonin on expression of MPO and CINC-1 in rats with acute spinal cord injury

MIAOJinhong1),ZHUHaiyang2),ZHONGBin2),CUIHao2),WANGXin2)，LIYang2),XUYusheng2)

1)TheFirstAffiliatedHospital,Zhengzhou450052 2)DepartmentofOrthopedics，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

melatonin;spinal cord injury;cytokine-induced neutrophil chemoattractant;myeloperoxidase；rat

Aim: To investigate the effects of melatonin(MT) on expression of myeloperoxidase(MPO) and cytokine-induced neutrophil chemoattractant(CINC)-1 in rats after acute spinal cord injury. Methods: Totally 108 SD rats were randomly allocated into 3 groups:sham operation group(group A，n=36),spinal cord injury group (group B，n=36), and MT treatment group (group C，n=36). Group B and C were established SCI animal models at T11 level. Lamina of vertebra was cut without spinal cord injury in the sham operation group. The rats of group C were injected 5%(V/V) alcohol into abdominal cavity after spinal cord injury while the rats of group B were injected MT(100 mg/kg). Fetching the spinal tissue at 1 h, 6 h, 12 h, 1 d, 3 d and 5 d after spinal cord injury. Chemical method was used to detect the expression of MPO. HE staining was performed to observe the pathological changes of the spinal cord in the 3 groups respectively. RT-PCR was used to detect the expression of CINC-1 mRNA in spinal cord tissue. Results: There were similar changing patterns of contents of CINC-1 and MPO, and the peak time of MPO was 12 h later than CINC-1. Compared the three groups except 1 h,group B had the highest level and group A had the lowest level regarding to the contents of CINC-1 and MPO, and the differences among them were statistical(P<0.05).Conclusion: MT could inhibit the expression of CINC-1 and reduce neutrophil infiltration,thus relieve inflammation reaction and protect spinal cord from damage.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.06.017

*河南省国际科技合作项目 134300510005

R681.5+4