HBx基因瞬时转染对SUDHL-4细胞增殖的影响*

张 艳，彭邦安，程旭芳，柏祥芳，牛 帅，王 宁，马 方，王庆端

1)河南省(郑州大学)医药科学研究院 郑州 450052 2)郑州大学药学院 郑州 450001 3)郑州市中心医院药学部 郑州 450007



HBx基因瞬时转染对SUDHL-4细胞增殖的影响*

张 艳1)△，彭邦安2)，程旭芳3)，柏祥芳2)，牛 帅2)，王 宁1)，马 方1)，王庆端1)

1)河南省(郑州大学)医药科学研究院 郑州 450052 2)郑州大学药学院 郑州 450001 3)郑州市中心医院药学部 郑州 450007

△女，1967年12月生，硕士，副研究员，研究方向：肿瘤药理，E-mail:zhangyan2008@zzu.edu.cn

HBx基因；脂质体转染；SUDHL-4细胞；增殖

目的：研究HBx基因瞬时转染对淋巴瘤细胞SUDHL-4增殖、细胞周期及凋亡的影响。方法：用分子克隆方法构建HBx基因的真核载体pcDNA3.1-X，利用脂质体转染法将pcDNA3.1-X转入淋巴瘤细胞SUDHL-4 中，构建整合有 HBx基因的淋巴瘤细胞株SUDHL-4-HBx，以SUDHL-4及转染空载体的细胞SUDHL-4-con作为对照，利用CCK8法检测细胞转染24、48、72和96 h后的增殖活性，绘制生长曲线；应用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况。结果：重组质粒双酶切结果及测序结果表明成功构建pcDNA3.1-X，转染后SUDHL-4细胞有HBx mRNA及蛋白的表达。与SUDHL-4组及SUDHL-4-con组相比，SUDHL-4-HBx组细胞的增殖能力下降，G0/G1期细胞比例增加，S期细胞比例减少，凋亡率升高(P<0.05)。结论：瞬时转染HBx基因后，SUDHL-4细胞增殖减缓，细胞周期阻滞于G0/G1期，凋亡率增加。

恶性淋巴瘤(malignant lymphoma，ML)是淋巴结和(或)结外部位淋巴组织的免疫细胞肿瘤，按病理类型分为霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma，HL)和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma, NHL)。在中国，每年新发恶性肿瘤中淋巴瘤约占4%，是第九大常见肿瘤，其在肿瘤导致的死亡排名中居第10位，其中以NHL为主，占ML的85%～90%。在每年新诊断的血液系统肿瘤中，淋巴瘤约占一半[1]。在淋巴瘤患者的治疗中，常常发现较多的肝炎病毒阳性患者，两者的关系日益受到关注。国内外临床观察及研究[2-5]提示HBV感染与B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)有关，ML的HBV感染率仅次于肝癌。目前HBV感染在NHL发生和进展中的作用尚不清楚。弥漫性大B细胞淋巴瘤(SUDHL-4)是最常见的一种B-NHL，作者采用基因转染的方法将HBx基因转入SUDHL-4细胞中，观察HBV对B-NHL细胞增殖的影响并探讨其可能的作用机制，为B-NHL的防治提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞株：SUDHL-4细胞购自ATCC细胞库。试剂：血液基因组柱式提取试剂盒购自康为世纪公司；胶回收试剂盒购自Qiagen公司；载体克隆试剂盒及DH10B感受态细胞购自中美泰和生物技术公司；无内毒素质粒抽提试剂盒购自康为世纪公司；pcDNA3.1-EGFP质粒购自北京天恩泽基因科技有限公司；EcoRⅠ、HindⅢ及T4连接酶购自NEB公司；Lipofectamine 2000转染试剂盒购自Invitrogen公司；Trizol总RNA提取试剂购自康为世纪公司；细胞凋亡检测试剂盒及细胞周期检测试剂盒购自凯基生物有限公司。

1.2 HBx基因的提取、制备 利用血液基因组柱式提取试剂盒提取HBV感染者血清的基因组DNA，根据GenBank中HBx基因全序列设计扩增引物，上游5’-ATGCAAGCTTATGGCTGCTAGGCTG TACTG-3’，下游5’-TGCGAATTCTTAGGCAGAGGT GAAAAAGTTG-3’。以上述HBV基因组DNA为模版，PCR扩增目的基因，产物在20 g/L的琼脂糖凝胶上电泳，观察电泳结果。

1.3 HBx基因测序载体构建 利用胶回收试剂盒胶回收目的片段，并用紫外分光光度计测定DNA浓度及纯度。利用载体克隆试剂盒将目的基因连接在pCloneEZ-TA-Amp/HC载体上后转化DH10B感受态细胞，经氨苄青霉素筛选出阳性菌落后扩大培养，提取质粒，PCR扩增产物经凝胶电泳鉴定，并取阳性菌落测序鉴定。

1.4 HBx基因真核载体构建 根据pCloneEZ-TA-Amp/HC载体及pcDNA3.1-EGFP载体的酶切位点，选用限制性内切酶HindⅢ和限制性内切酶EcoRⅠ进行双酶切，利用 T4连接酶将两目的片段连接成重组质粒后转化感受态细胞，经氨苄青霉素筛选出阳性单菌落，挑选克隆后提取质粒，凝胶电泳及测序鉴定。

1.5 HBx基因转染 将SUDHL-4细胞接种于含Opti-MEMⅠ无血清培养基的6孔板中，利用Lipofectamine 2000将重组质粒转入细胞，命名为SUDHL-4-HBx组，同时设空白对照组及转染空载体对照组，分别命名为SUDHL-4组和SUDHL-4-con组，每组3个复孔，在37 ℃、体积分数5% CO2的培养箱中培养48 h后利用荧光显微镜观察转染情况及细胞状态。

1.6 RT-PCR检测HBx mRNA表达 转染48 h后利用Trizol试剂提取各组细胞的总RNA，使用紫外分光光度计测定总RNA的纯度和浓度，并通过凝胶电泳进行RNA完整性测定。逆转录反应合成cDNA链后通过RT-PCR扩增HBx基因，在465 bp处出现条带则表明HBx基因在SUDHL-4细胞中成功表达。

1.7 Western bolt 检测HBx 蛋白表达 转染48 h后收集各组细胞，利用RIPA Buffer裂解液提取各组细胞总蛋白，取20 μL蛋白样品进行SDS-PAGE电泳并在恒流200 mA、冰水浴条件下电转60 min转移至PVDF膜上，50 g/L的脱脂奶液封闭液完全封闭1 h，以封闭液按11 000稀释HBx抗体，将上述PVDF膜浸泡其中孵育3 h后用TBST溶液洗膜，然后与18 000稀释的二抗孵育1 h后利用ECL试剂发光显色，在17 000处出现条带则表明HBx蛋白在SUDHL-4细胞中成功表达。

1.8 CCK8法检测细胞增殖活性 取3组细胞以1×107L-1接种于96孔板中，每孔100 μL，培养24、48、72、96 h后每孔加入10 μL CCK8试剂，4 h后在450 nm波长下检测各孔OD值，重复3次取均值。以OD值为纵坐标，时间为横坐标，绘制生长曲线。

1.9 流式细胞仪检测细胞周期 收集转染48 h后的3组细胞，用冷PBS洗涤细胞后加入体积分数70%冷乙醇固定过夜。用流式细胞仪进行检测，采用Cell Quest软件分析细胞周期分布情况。实验重复3次。

1.10 流式细胞仪检测细胞凋亡率 收集转染48 h后的3组细胞，于染色前用预冷的PBS洗涤细胞并离心，按 AnnexinⅤ-FITC/PI 凋亡检测试剂盒说明书操作，于1 h内上流式细胞仪检测，用Cell Quest软件分析细胞凋亡情况，计算细胞凋亡率。实验重复3次。

1.11 统计学处理 采用SPSS 21.0进行数据分析。不同组间细胞凋亡率和细胞周期的比较均采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 HBx基因的制备 PCR结果见图1。可见464 bp的目的片段，与预期相符。

1：DNA Marker；2：HBx基因阳性表达；3：对照。图1 PCR扩增HBx基因结果

2.2 HBx基因真核载体鉴定 凝胶电泳结果(图2)和测序结果显示成功构建HBx基因真核载体。紫外分光光度计测定重组质粒的浓度为0.145 g/L，其OD260 nm/OD280 nm为1.82，表明重组质粒有较高的浓度和纯度，可进行下一步实验。

1：DM10000 DNA Marker；2：pcDNA3.1；3：pcDNA3.1-X；4：100 bp DNA Marker。图2 重组质粒双酶切鉴定结果

2.3 转染HBx后细胞形态变化 转染48 h后在荧光显微镜下观察SUDHL-4细胞的形态变化情况，发现转染后细胞发生皱缩，且可以观察到绿色荧光，见图3。

A:SUDHL-4组；B:SUDHL-4-con组；C:SUDHL-4-HBx组。图3 荧光显微镜下细胞转染情况(×200)

2.4 HBx mRNA的表达 紫外分光光度计测得3组细胞总RNA均有较高的浓度和纯度。将各组总RNA进行凝胶电泳实验，其中28S处亮度大约为18S处亮度的2倍，即各组总RNA完整性较好，可进行下一步实验。将PCR扩增产物进行凝胶电泳，可见SUDHL-4-HBx组有目的片段出现，而其他2组未见mRNA的表达，见图4。

1：DNA Marker；2：SUDHL-4-HBx组；3：SUDHL-4组；4：SUDHL-4-con组。图4 PCR产物凝胶电泳结果

2.5 HBx蛋白的表达 Western bolt 结果显示SUDHL-4-HBx组在17 000处有蛋白条带(即HBx蛋白)，而SUDHL-4组和SUDHL-4-con组未见表达，见图5。

A:SUDHL-4组；B:SUDHL-4-con组；C:SUDHL-4-HBx组。图5 3组细胞中HBx蛋白的表达

2.6 转染HBx后各组细胞的生长曲线 与其他2组比较，SUDHL-4-HBx组细胞增殖减缓，见图6。

图6 瞬时转染HBx基因对SUDHL-4细胞增殖的影响

2.7 转染HBx后各组细胞凋亡率和细胞周期 SUDHL-4-HBx组与其他2组相比，G0/G1期细胞增多，S期细胞减少，细胞凋亡率增加，见表1。

表1 瞬时转染HBx后 各组细胞周期及凋亡率比较(n=3) %

*：与其他2组相比,P<0.05。

3 讨论

淋巴瘤的病因与发病机制很复杂[6]，其中病毒的慢性感染在淋巴瘤的发生过程中起重要作用，如EB病毒感染和淋巴瘤的关系已经得到充分证实。HBV是一种嗜肝细胞病毒，而且还具有较强的亲淋巴细胞特性，和B细胞来源的淋巴瘤有关。大量的临床研究[2-5]也表明NHL患者HBV感染率明显高于普通人群及其他实体肿瘤患者，ML HBV的感染率仅次于肝癌；同时HBV的再激活在NHL合并HBV感染患者的治疗中表现突出，这充分表明HBV感染与淋巴瘤的发生有一定的相关性。

HBx蛋白是一种多功能蛋白，对细胞的凋亡具有双向调控作用，可因其细胞类型、HBV感染阶段、细胞因子及干预因素等的不同而表现出促进或者抑制细胞凋亡两种不同的作用。HBx基因诱导细胞凋亡可能主要通过以下几种途径进行：上调c-myc的表达，使细胞对TNF-α介导的凋亡信号敏感[7]；拮抗Bcl-2的凋亡抑制作用；与DDB1竞争性结合DDB2，以DDB1非依赖形式介导细胞凋亡[8]；定位线粒体膜，和电压依赖的离子通道蛋白结合，使线粒体跨膜电压下降，诱导细胞凋亡因子的释放及诱导氧自由基的损伤等[9]。

该实验利用脂质体转染法将HBx基因导入SUDHL-4细胞中，结果显示脂质体转染48 h后SUDHL-4-HBx组细胞有HBx mRNA和蛋白的表达。瞬时转染HBx基因后淋巴瘤细胞增殖减缓，在G0/G1期发生细胞阻滞，细胞凋亡率显著增加。

病毒感染宿主细胞后，病毒蛋白引发细胞凋亡是病毒感染过程中的普遍现象[10-11]；HBx基因诱导细胞凋亡的作用可促使细胞免疫逃逸；加强细胞再生反应，促进HBV的细胞感染；还可降低机体抗炎反应，促进病毒的扩散[12]，这都表明HBx基因诱导凋亡的作用也可促进细胞恶性转化。瞬时转染实验可揭示HBV感染初期HBx基因对淋巴瘤细胞可能的作用机制，为下一步研究稳定表达HBx基因对SUDHL-4细胞的影响提供参考依据。

[1]刘志刚,徐才刚.淋巴瘤的发病现状与危险因素[J].西部医学,2013,25(7):961

[2]MARCUCCI F,MELE A.Hepatitis viruses and non-Hodgkin lymphoma:epidemiology, mechanisms of tumorigenesis, and therapeutic opportunities[J].Blood,2011,117(6):1792

[3]CHEN J,WANG J,YANG J,et al.Concurrent infection of hepatitis B virus negatively affects the clinical outcome and prognosis of patients with non-Hodgkin′s lymphoma after chemotherapy[J].PLoS One,2013,8(7):e69400

[4]DALIA S,CHAVEZ J,CASTILLO JJ,et al.Hepatitis B infection increases the risk of non-Hodgkin lymphoma:a meta-analysis of observational studies[J].Leuk Res,2013,37(9):1107

[5]郑丹,王树叶,王巍,等.257例非霍奇金淋巴瘤患者乙型肝炎病毒感染分析[J].医学综述,2012,18(13):2119

[6]高怡瑾.儿童非霍奇金淋巴瘤的诊断与治疗[J].实用儿科临床杂志,2012,27(3):160

[7]SHUKLA SK,KUMAR V.Hepatitis B virus X protein and c-Myc cooperate in the upregulation of ribosome biogenesis and in cellular transformation[J].FEBS J,2012,279(20):3859

[8]JIANG T,LIU M,WU J,et al.Structural and biochemical analysis of Bcl-2 interaction with the hepatitis B virus protein HBx[J].Proc Natl Acad Sci USA,2016,113(8):2074

[9]LEE YI,HWANG JM,IM JH,et al.Human hepatitis B virus-X protein alters mitochondrial function and physiology in human liver cells[J].J Biol Chem,2004,279(15):15460

[10]RAJPUT P,SHUKLA SK,KUMAR V.The HBx oncoprotein of hepatitis B virus potentiates cell transformation by inducing c-Myc-dependent expression of the RNA polymerase Ⅰ transcription factor UBF[J].Virol J,2015,12:62

[11]赵晓彪,李光耀,刘孟刚,等.Tmub1过表达及沉默慢病毒载体转染对大鼠BRL-3A肝细胞增殖的影响[J].解放军医学杂志,2016,41(1):12

[12]白洋禄.乙型肝炎病毒感染与淋巴瘤关系的研究[D].南宁:广西医科大学,2014.

(2016-07-28收稿 责任编辑姜春霞)

Effects of HBx gene transient transfection on proliferation of SUDHL-4 cells

ZHANGYan1),PENGBang′an2),CHENGXufang3),BAIXiangfang2),NIUShuai2),WANGNing1),MAFang1),WANGQingduan1)

1)HenanAcademyofMedicalandPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)CollegeofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 3)DepartmentofPharmacy,ZhengzhouCentralHospital,Zhengzhou450007

HBx gene;lipofection transfection;SUDHL-4 cell;proliferation

Aim: To investigate the effects of HBx transient transfection on proliferation, cell cycle and apoptosis in lymphoma cell SUDHL-4. Methods: The HBx eukaryon expression vector pcDNA3.1-X was established through recombi nation DNA technique. The reconstituted plasmid pcDNA3.1-X and empty vector pcDNA3.1 were transfected into SUDHL-4 cells which were named SUDHL-4-HBx and SUDHL-4-con. Untransfected SUDHL-4 and SUDHL-4-con were used as control. The CCK8 experiment was performed to detect the reproductive ability of cells in 24, 48, 72 and 96 h,and growth curves were obtained. Cell apoptosis and cell cycle were detected by flow cytometry. Results: The reconstituted plasmid pcDNA3.1-X was identified by restriction enzyme digestion and nucleotide sequencing, the expressions of HBx mRNA and protein were confirmed in the SUDHL-4 cells transfected with HBx. Compared with SUDHL-4 group and SUDHL-4-con group, the proliferative capacity of cells in SUDHL-4-HBx group was obviously decreased. Flow cytometry analysis showed that HBx transfection significantly increased G0/G1phase proportion and cell apoptosis rate when comparing with SUDHL-4 and SUDHL-4-con groups(P<0.05). Conclusion: HBx transient transfection could inhibit SUDHL-4 cell proliferation by blocking cell cycle in G0/G1phase and increasing cell apoptosis.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.06.007

*河南省重点科技攻关计划项目 142102310085

R733.4