油菜茎基溃疡病菌与黑胫病菌菌丝的生长动态

叶芸++张建坤++王琴++徐雪++王振华

摘要：比较了油菜茎基溃疡病菌（Leptosphaeria maculans）和油菜黑胫病菌（L. biglobosa）在不同培养温度和2种培养基上的菌丝生长动态。结果表明，在PDA和V8培养基平板上都生长良好，油菜茎基溃疡病菌培养温度在28 ℃时，油菜黑胫病菌培养温度在25 ℃或28 ℃时，在PDA平板上菌丝生长最好；油菜黑胫病菌与油菜茎基溃疡病菌菌落生长速度相比，在最适培养温度（25 ℃或28 ℃）和相同的培养时间 （21 d）内，二者在PDA平板上的菌落生长速度分别为5～7 mm/d和2.0 mm/d，前者的菌落直径约90 mm，是后者的2倍。因此，在温度为25 ℃或28 ℃的条件下，PDA培养基最适合这2种病菌的生长。

关键词：油菜茎基溃疡病菌（Leptosphaeria maculans）；油菜黑胫病菌（L. biglobosa）；菌丝生长

中图分类号：S435.654 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）18-4708-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.18.021

油菜茎基溃疡病菌（Leptosphaeria maculans）和油菜黑胫病菌（L. biglobosa）均为茎点霉属真菌，可引起油菜严重的病害[1-6]。由于频繁的油菜国际间贸易，黑胫病原菌目前已扩散到世界多数油菜生产国，导致病害的发生。油菜的子叶、真叶、茎秆、根以及荚果等都有可能被黑胫病原菌侵染，其中以叶片和茎基部的感染症状最为常见[6]。油菜茎基溃疡病菌可在十字花科植物上广泛传播，在叶片和茎秆上形成典型的茎点病斑，继而在主茎及分枝上形成黑色的条状茎腐病斑，造成幼苗或成株死亡，导致菜子产量和品质的下降[4，7]。现已成为世界性的重要病害。为此，本试验对这2种病菌在不同培养平板上的培养特征进行了研究，以便找到快速培养这2种病菌的方法[2，5]。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

本试验所用油菜黑胫病菌XGL-1、SS-13（根）、10ZJ-1（茎）、SYL-2B（叶）菌株为华中农业大学李国庆教授所提供。油菜茎基溃疡病菌的阳性对照分离物为湖北出入境检验检疫局收藏的标准菌株ATCC 60737。

1.2 菌株的分离纯化

将菌株ATCC 60737、XGL-1、SS-13（根）、10ZJ-1（茎）、SYL-2B（叶）直径5 mm的菌丝碟片接种到马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基平板中央，于25 ℃培养，10～15 d后挑取其产生的分生孢子器，在20 ℃下进行纯化培养，观察菌丝的生长状况。

1.3 油菜黑胫病菌最适生长温度的筛选

在活化14 d的SS-13（根）、10ZJ-1（茎）、SYL-2B（叶）的PDA培养基平板边缘取直径5 mm的菌丝碟片，分别接种于PDA培养基平板中进行不同温度的恒温黑暗培养。试验设置5个温度梯度，4、10、15、25、30 ℃，每个温度每种菌株5皿，每3～5 d观察记录菌丝的生长状况，取平均值。

1.4 两种病菌生长速度比较

在活化14 d的ATCC 60737、XGL-1的PDA培养基平板边缘取直径5 mm的菌丝碟片，分别接种于PDA和V8培养基平板中进行不同温度的恒温黑暗培养。试验设置4个温度梯度15、20、25、28 ℃，每个温度每种菌株5皿，每3～5 d观察记录菌丝的生长状况，取平均值。

2 结果与分析

2.1 油菜黑胫病菌最适生长温度筛选

不同油菜植株部位分离的油菜黑胫病菌菌株SS-13（根）、10ZJ-1（茎）、SYL-2B（叶）在5个温度（4、10、15、25、30 ℃）、黑暗、PDA平板上的菌丝生长速度见图1。由图1可知，最适生长温度为25 ℃，菌落扩展速度约为5.0 mm/d。同种培养条件下，分离自根部的菌株（SS-13）菌丝生长最快，但各菌株的菌落扩展速度无明显差异。结果表明，油菜黑胫病菌不同部位分离的菌株在油菜生长期均可侵染，该病菌在离体条件下生长较快，培养初期产生绒毛状白色菌丝，呈直线式生长，产生很少短的分枝，菌落规则，分生孢子器主要形成于菌落中央，菌丝的气生部分形成黄色或褐色液体小滴，在PDA培养基上释放深棕色色素。

2.2 油菜茎基溃疡病菌ATCC 60737在不同培养基上的生长速度

油菜茎基溃疡病菌在4个不同温度下黑暗培养时发现，该病菌在PDA和V8平板上生长良好，生长速度较稳定，在平板上释放黑色色素，形成白色平坦菌落，气生菌丝短小，有较多的分支菌丝，形成分生孢子器相对较少。当温度为25 ℃时，该病菌的菌落在PDA平板上扩展速度约为1.8 mm/d，在V8平板上约为1.4 mm/d；当温度为28 ℃时，该菌落在PDA平板上扩展速度增加至2.0 mm/d，在V8平板上扩展速度增加至1.8 mm/d。因此，油菜茎基溃疡病菌的最适生长温度为28 ℃，最适培养基为PDA培养基（图2）。

2.3 油菜黑胫病菌XGL-1在不同培养基上的生长速度

油菜黑胫病菌在PDA和V8平板上均能生长，但在相同时间和相同培养温度下菌落在PDA平板上扩展速度大于在V8平板上的扩展速度。18 d后PDA平板上的菌落直径最大，21 d后V8平板上的菌落直径达到最大。XGL-1在PDA平板上菌落的扩展速度约为5～7 mm/d，在V8平板上菌落的扩展速度约为3.5～4.5 mm/d。XGL-1在V8平板上的生长速率小，气生菌丝更发达，菌丝扩展不均匀，菌落形状不规则，菌丝的气生部分形成淡棕色油状液滴，菌丝在平板中部集中生长，生长后期V8培养基颜色呈黑褐色（图3）。

2.4 两种病菌在最适温度的PDA培养基上的扩展速度比较

油菜黑胫病最适生长温度为25 ℃和28 ℃，油菜茎基溃疡病菌最适生长温度为28 ℃，培养基均为PDA培养基。在培养温度为25 ℃或28 ℃时，相同培养时间下油菜黑胫病菌菌落的生长速度远大于油菜茎基溃疡病菌，培养18 d后，油菜黑胫病菌的菌落直径达到最大，近90 mm，而油菜茎基溃疡病菌菌落直径不足其一半（图4）。

3 小结与讨论

油菜茎基溃疡病菌对油菜表现为强致病性，在离体条件下生长相对缓慢，培养物表面呈暗灰色；油菜黑胫病菌对油菜表现为弱致病性，在离体条件下生长较快，产生绒毛状白色菌丝，呈直线式生长，很少产生短的分枝，菌落规则，分生孢子器主要形成于菌落中央，可产生大量子座和孢子，菌丝的气生部分形成黄色或褐色液体小滴，在PDA培养基上释放深棕色色素。在显微镜下可观察到XGL-1的孢子呈长梭形，两端各有一个油滴状的透明物。油菜茎基溃疡病菌菌落边缘不整齐、有结节状颗粒点，气生菌丝白色、多而致密，分枝较多，有分隔，分生孢子器球形至扁球形，褐色至深黑褐色，散生、埋生或半埋生于菌丝中，分生孢子无色透明，椭圆形至纺锤形，两端常见各1个油球，培养物表面有黑色色素生成。

油菜黑胫病菌和油菜茎基溃疡病菌在PDA或V8培养基上均可生长良好，但生长速度相差明显。油菜黑胫病菌的最适生长温度为25和28 ℃，在PDA培养基上菌落生长速度为5～7 mm/d；油菜茎基溃疡病菌的最适生长温度为28 ℃，在PDA培养基上菌落生长速度为2.0 mm/d。

油菜茎基溃疡病菌和黑胫病菌的试验表明，在湖北省内油菜黑胫病菌可能广泛存在，应引起有关部门的重视，加强油菜黑胫病的防治力度，避免油菜黑胫病的大发生[3]。油菜茎基溃疡病菌ATCC 60737的培养温度与油菜黑胫病菌XGL-1基本一致。因此，作为检疫性的病原菌，如果传入中国，其定殖、病害发生与流行就具有理论上的可能性。

参考文献：

[1] WILLIAMS R H，FITT B D L. Differentiating A and B groups of Leptosphaeria maculans，causal agent of stem canker （blackleg） of oilseed rape[J].Plant Pathology，1999，48（2）：161-175.

[2] 王振华，赵 晖，宋 祺，等.加拿大进境油菜籽加工过程中油菜茎基溃疡病菌的检测与鉴定[J].植物检疫，2010，24（6）：25-26.

[3] 王振华，杨 武，赵 晖，等.加拿大进境油菜籽茎基溃疡病菌的检测与鉴定[J].华中农业大学学报，2011，30（1）：66-69.

[4] SIVASITHAMPARAM K，BARBETTI M J，LI H. Recurring challenges from a necrotrophic fungal plant pathogen：A case study with Leptosphaeria maculans（causal agent of blackleg disease in brassicas） in Western Australia[J].Ann Bot，2005，96（3）：363-377.

[5] MORENO-RICO O，FRIAS-TREVI？譙O A G，LUNA-RUIZ J J，et al. Characterization and pathogenicity of isolates of Leptosphaeria maculans from Aguascalientes and Zacatecas，Mexico[J].Can J Plant Pathol，2001，23（3）：270-278.

[6] FITT B D L，BRUN H，BARBETTI M J，et al. World-wide importance of phoma stem canker（Leptosphaeria maculans and L. biglobosa） on oilseed rape（Brassica napus）[J].European Journal of Plant Pathology，2006，114（1）：3-15.

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