圈养林麝养殖场内铜绿假单胞菌的分布及其耐药性分析

郗立新，文彩芳，赵 珊，陈珍容，卓利苗，杨光友，颜其贵，2，*，郑从军，王洪永，夏中林

(1.四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130； 2.四川农业大学 动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 成都 611130； 3.四川省宝兴县林业局，四川 雅安 625700； 4.四川夹金山逢春养殖科技有限公司，四川 德阳 618100； 5.四川省峨眉山市林业管理局，四川 峨眉山 614200)



圈养林麝养殖场内铜绿假单胞菌的分布及其耐药性分析

郗立新1，文彩芳1，赵 珊1，陈珍容1，卓利苗1，杨光友1，颜其贵1，2，*，郑从军3，王洪永4，夏中林5

(1.四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130； 2.四川农业大学 动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 成都 611130； 3.四川省宝兴县林业局，四川 雅安 625700； 4.四川夹金山逢春养殖科技有限公司，四川 德阳 618100； 5.四川省峨眉山市林业管理局，四川 峨眉山 614200)

从陕西镇坪、四川宝兴两个林麝养殖中心共采集124份样品进行铜绿假单胞菌的分离鉴定，并采用微量肉汤稀释法检测其耐药情况。结果显示，共分离出60株铜绿假单胞菌，其中镇坪34株，宝兴26株。两个养殖场铜绿假单胞菌检出率由高到低依次为伤口脓汁>死亡林麝组织器官>伤皮>鼻拭子>土壤>粪便>尿液>空气，且镇坪比宝兴的总检出率高。所分离的60株铜绿假单胞菌耐药表型趋于一致，都对阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星敏感，对亚胺培南中等敏感，对多西环素、四环素、磺胺异恶唑严重耐药。

林麝；铜绿假单胞菌；分离鉴定；药敏

林麝因产麝香而成为珍贵的药用资源动物。近年来，由于麝香需求量增加，野生林麝的捕杀量迅速增多，国家一级保护动物——林麝的野生资源遭到严重破坏[1]。开展规范化人工养麝是保护野生资源、解决麝香资源短缺的有效途径，但目前我国在林麝的人工养殖技术、疾病防治等方面的研究还较少[2-3]。在实际生产中，化脓性疾病是林麝的主要疾病之一，对人工养殖影响很大[4]。据统计，患化脓性疾病的林麝占病麝的50%以上，在因病死亡的林麝中，与化脓有关的占死亡总数50%以上[5]。林麝化脓性疾病病原多样、病因复杂，但主要以铜绿假单胞菌(绿脓杆菌)、金黄色葡萄球菌、化脓棒状杆菌等感染为主[6]。

本研究通过对圈养林麝饲舍环境以及林麝体表、鼻腔分泌物、尿液和粪便等采样检测，分析铜绿假单胞菌在饲舍内的分布与引发化脓性疾病间的关系，为防控铜绿假单胞菌感染提供依据，同时采用微量肉汤稀释法调查铜绿假单胞菌的耐药情况，为临床上优化用药提供科学指导。

1 材料与方法

1.1 样品采集

参照文献[7]的方法，于空气、土壤、粪便、饮水、污水、卧台、鼻腔黏液棉拭子、尿液、伤皮、脓汁、血液、死亡病麝部分脏器共采集124份样品，其中，64份采集于四川宝兴逢春林麝养殖场，60份采集于陕西镇坪逢春林麝养殖场。病麝脏器样品来源于前述养殖场2014年10月—2015年4月间非正常死亡的林麝，其余样品均分别在前述养殖场内于同一时间完成采集。

1.2 主要试剂及抗生素药品

微量生化鉴定管购自杭州微生物试剂有限公司；MH肉汤培养基、NAC培养基、NA营养琼脂、无菌脱纤绵羊血购自青岛日水生物技术有限公司；DNA分子标记、2×TaqPCR master mix购自TaKaRa公司；头孢曲松(CRO)、多西环素(DOX)、阿米卡星(AMK)、亚胺培南(IPM)、庆大霉素(GEN)、阿奇霉素(AZI)、环丙沙星(CIP)、四环素(TET)、氨曲南(AZM)、磺胺异恶唑(SUL)均购自中国兽医药品监察所；大肠埃希菌ATCC25922与铜绿假单胞菌ATCC27853用作质控菌株，由四川农业大学动物医学院药学系实验室惠赠。

1.3 样品处理及接菌计数

[8-9]的方法进行样品预处理接菌、样品细菌总数计数及样品中铜绿假单胞菌计数。

1.4 菌落形态特征及染色镜鉴观察

将铜绿假单胞菌纯化后分别接种于NA营养琼脂培养基、NAC培养基及血琼脂培养基，对菌落形态进行描述，并进行革兰氏染色镜鉴。

1.5 分子生物学鉴定

采用细菌16S rRNA通用引物[10]，对菌株进行PCR鉴定。反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，目的条带纯化回收后送成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。

1.6 理化特性观察

结合菌株来源情况以及菌落形态特征，分别随机从镇坪、宝兴样品中各选取10株，共20株分离菌株，纯化培养后，按常规方法进行生化鉴定。

1.7 药敏试验

参照美国临床和实验室标准协会(clinical and laboratory standards institute，CLSI)标准，采用微量肉汤稀释法对所有分离菌株进行耐药表型测定，并进行多重耐药分析。

2 结果与分析

2.1 林麝饲舍环境细菌分布

共采集124份样品，除饮水、卧台、血液样品外，其余样品类型均分离出铜绿假单胞菌，共计60株，其中，从镇坪样品中分离出34株，依次编为PA-ZP01至PA-ZP34，从宝兴样品中分离出26株，依次编为PA-BX01至PA-BX26。具体统计数据详见表1。

表1 林麝饲舍环境内铜绿假单胞菌检出情况
Table 1P.aeruginosadistribution in forest musk deer breeding farm

样品来源Samplesource取样地区Samplesite样品数量Samplequantity检出数量Detectedquantity检出率Detectionrate/%空气Air镇坪Zhenping6233.3宝兴Baoxing6116.7土壤Soil镇坪Zhenping6350.0宝兴Baoxing6116.7粪便Feces镇坪Zhenping6350.0宝兴Baoxing6350.0鼻拭子Nasalswabs镇坪Zhenping4250.0宝兴Baoxing4250.0饮水Water镇坪Zhenping300宝兴Baoxing300尿液Urine镇坪Zhenping3133.3宝兴Baoxing3133.3卧台Bedroomsets镇坪Zhenping300宝兴Baoxing300伤皮Skinwounds镇坪Zhenping4375.0宝兴Baoxing4250.0脓汁Pus镇坪Zhenping44100宝兴Baoxing4250.0血液Blood镇坪Zhenping300宝兴Baoxing300剖解脏器Organs镇坪Zhenping181688.9宝兴Baoxing221463.6合计Total镇坪Zhenping603456.7宝兴Baoxing642640.6

2.2 菌落形态观察

陕西镇坪分离菌株在NA营养琼脂培养基上主要形成2种菌落形态：一种为圆形，表面有金属光泽，产蓝绿色色素且有生姜气味；一种为椭圆形，表面有金属光泽，产蓝绿色色素且有生姜气味。四川宝兴分离菌株在NA营养琼脂培养基上主要形成1种圆形、表面有金属光泽、产蓝绿色色素且有生姜气味的菌落形态。60株分离菌在NAC培养基上均产生明显的玫红色，在血琼脂培养基上均产生透明β-溶血环，革兰氏染色镜鉴结果均为革兰氏阴性杆菌。

2.3 分离菌株的16S rRNA扩增及测序鉴定结果

琼脂糖凝胶电泳检测16S rRNA的扩增片段大小约1500bp，与预期目的片段大小一致。测序结果经BLAST分析比对显示，所有分离菌株的16S rRNA基因部分序列与铜绿假单胞菌同源性高达99%以上，确定分离菌株均为铜绿假单胞菌。

2.4 分离菌株的理化鉴定

将单个菌落接种于微量生化管中进行鉴定，培养特性结果显示，该菌发酵糖的能力不强，分解葡萄糖产酸不产气，分解尿素，不形成吲哚，氧化酶试验阳性，可利用枸椽酸盐，不产生H2S，MR、VP试验均为阴性。对照说明书检索结果，所选取菌株均为铜绿假单胞菌。

2.5 药敏试验结果

不同地区林麝养殖场内分离的铜绿假单胞菌对10种抗菌药物的耐药率总体趋于一致，但是部分抗菌药物耐药率存在较大差异(表2)：镇坪所有分离株对头孢曲松、阿奇霉素、多西环素、四环素、磺胺异恶唑均表现出极高的耐药性，对氨曲南、亚胺培南表现出中等耐药性，对阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星表现出敏感性；宝兴所有分离株对多西环素、四环素、磺胺异恶唑表现出极高的耐药性，对头孢曲松、阿奇霉素、亚胺培南、氨曲南表现出中等耐药性，对阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星表现出敏感性。

表2 铜绿假单胞菌分离株对抗菌药物的耐药率
Table 2 Antimicrobial resistance rate ofP.aeruginosaisolates

取样地区Samplesite样品来源Samplesource分离菌株数No.ofisolates耐药率Ratioofdrugresistance/%头孢曲松CRO氨曲南AZM阿奇霉素AZI阿米卡星AMK庆大霉素GEN多西环素DOX四环素TET磺胺异恶唑SUL环丙沙星CIP亚胺培南IPM镇坪空气Air210050.010000100100100050.0Zhenping土壤Soil366.733.31000010066.7100033.3粪便Feces310001000066.710010000鼻拭子Nasalswabs2100010000100100100050.0尿液Urine110001000010010010000伤皮Skinwounds3100010000100100100033.3脓汁Pus475.025.01000010075.0100025.0剖解脏器Organs1687.531.275.06.2537.5100100100037.5合计Total3488.223.588.22.9417.697.194.1100032.4宝兴空气Air100100001001001000100 Baoxing土壤Soil11001001000010010010000粪便Feces3033.366.700100100100066.7鼻拭子Nasalswabs250.050.000010010010000尿液Urine101000001001001000100伤皮Skinwounds250.001000010010010000脓汁Pus210050.050.0001001001000100剖解脏器Organs1428.614.371.47.147.14100100100035.7合计Total2664.329.265.43.843.84100100100046.2

2.6 多重耐药分析

对60株林麝养殖场内分离得到的铜绿假单胞菌对10种抗菌药物的多重耐药性进行分析，从图1可以看出，60株菌对所有抗菌药物均呈3耐及3耐以上的多重耐药性，多重耐药菌株中以5耐(镇坪41.18%、宝兴46.15%)为主。

图1 分离到的铜绿假单胞菌对不同抗菌药物的多重耐药性Fig.1 Multi-resistance of 60isolates of P.aeruginosa to different antimicrobial agents

3 讨论

3.1 林麝饲舍环境中铜绿假单胞菌的分布检测与分离鉴定

目前，关于圈养林麝养殖场内铜绿假单胞菌的分布研究未见报道。张邓华等[7]通过对重庆动物园动物环境中常见病原菌的调查发现，动物饲舍环境的细菌污染指数除与饲舍内的通风、温度、湿度、光照等因素有关外，与饲舍中所饲养的动物种类、动物的生活习性及动物的密度和日常饲养管理也有密切的关系。本研究镇坪与宝兴样品中铜绿假单胞菌检出率存在明显差异，从试验结果可以看出：(1)饲舍内通风不良，且镇坪比宝兴情况更严重，使得空气成为感染源，容易引发伤口感染或呼吸道感染；(2)铜绿假单胞菌可通过粪便、尿液排出，并可能污染土壤使其成为感染源；(3)除死亡病麝脏器外，两个地区养殖场中伤口化脓液与伤口皮肤的铜绿假单胞菌检出率最高，可能是铜绿假单胞菌与其他细菌的混合感染造成伤口化脓；(4)虽然饮水、卧台和血液样品中均未检出铜绿假单胞菌，但是饮水、卧台样品中仍检出其他细菌，因其与林麝有直接接触，所以平时要加强消毒灭菌，减少患病风险。

伍清林等[11]对南京红山森林动物园部分动物的生存环境进行检测发现，土壤中的细菌菌落总数、铜绿假单胞菌数相对较多，土壤是动物感染环境中铜绿假单胞菌的主要来源。但本研究显示，镇坪与宝兴两个养殖场最大的感染源是伤口脓汁、伤皮，其次为鼻拭子、土壤、粪便、尿液和空气。建议两个养殖场的饲养管理人员加强饲舍通风，注意防寒保暖，减少外界因素对林麝的刺激，定期对饲舍进行全面消毒，每天按时打扫圈舍并及时更换饮水，做好疾病监测，发现病麝及时隔离，防止交叉感染。

3.2 铜绿假单胞菌的耐药性分析

多数报道认为，铜绿假单胞菌对庆大霉素、多粘菌素、羧苄西林等药物敏感，对治疗铜绿假单胞菌感染引起的化脓性炎症有效[12-13]；也有报道认为，头孢他啶是治疗铜绿假单胞菌感染的首选药物[14]。然而铜绿假单胞菌有复杂的耐药机制，加之抗生素的不合理使用，总体来说耐药率不断上升[15]，这使其相关疾病的治疗变得越来越棘手。

本试验中两个地区养殖场分离的铜绿假单胞菌耐药情况趋于一致，这与两个养殖场所处的地理环境和抗菌药物的使用情况密切相关。有报道认为，环境胁迫是细菌变异进化的重要诱因[16]，两个养殖场均位于海拔1500m左右的山区，气候类型都属于亚热带山地湿润气候，环境条件基本一致。也有报道认为，抗菌药物的选择压力与细菌耐药相关[17]，考虑到企业可能针对常见疾病的治疗对各个养殖场的兽医人员进行过相同的指导培训，所以两个养殖场在抗菌药物的选择和使用上也较为一致，这就造成了相同或者相近的抗菌药物选择压力。60株分离菌对磺胺类、大环内酯类、四环素类抗菌药物耐药率高达65%以上，这可能是抗菌药物的不合理使用与铜绿假单胞菌自身耐药机制共同作用导致。镇坪分离菌对头孢曲松耐药率较高，比较发现，该养殖场在治疗林麝化脓性炎症时均首选头孢曲松，这可能是主要诱因。两个养殖场的多重耐药情况均十分严重，可能是兽医人员长期使用同种药物治疗化脓性疾病所致，建议在使用抗生素药物之前，进行简易药敏试验并遵循试验结果合理用药。根据本试验结果，喹诺酮类药物是治疗两个养殖场铜绿假单胞菌感染的较为理想的药物，可与氨基糖苷类抗菌药物联合用药，以达到最佳的治疗效果。

综上所述，化脓性病灶是两个林麝养殖场饲养环节中最大的铜绿假单胞菌污染源，喹诺酮类药物是治疗镇坪、宝兴林麝养殖场铜绿假单胞菌感染的最佳用药。此研究结果可为跨地区林麝化脓性炎症的防控与治疗提供理论依据，同时也可为林麝的日常饲养管理提供科学参考。

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(责任编辑 高 峻)

Distribution-survey of Pseudomonas aeruginosa of captive forest musk deer and analysis of drug resistance

XI Li-xin1，WEN Cai-fang1，ZHAO Shan1，CHEN Zhen-rong1，ZHUO Li-miao1，YANG Guang-you1，YAN Qi-gui1，2，*，ZHENG Cong-jun3，WANG Hong-yong4，XIA Zhong-lin5

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China; 2.AnimalEpidemicDiseaseandHumanHealthKeyLaboratoryofSichuanProvince，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China; 3.SichuanBaoxingCountyForestryBureau，Ya’an625700，China; 4.SichuanFeng-chunBreedingTechnoloygCo.，Ltd,Deyang618100，China; 5.E’meishanForestryAdministrationBureauofSichuanProvince，E’meishan614200，China)

A total of 124samples were collected from Zhenping Country，Shaanxi Province and Baoxing Country，Sichuan Province，and were used to isolate and identifyPseudomonasaeruginosa，as well as to test their drug resistance by traditional bacteriological identification methods.It was shown that 60P.aeruginosastrains were isolated，of which 34were isolated from Zhenping，and 26were isolated from Baoxing.The detection rate decreased as wound pus>dead deer tissues and organs>skin wounds>nasal swabs>soil>feces>urine>air.The detection ratio of Zhenping samples was higher than that of Baoxing.All 60isolatedP.aeruginosastrains exhibited similar resistance phenotypes.All strains were sensitive to amikacin，gentamicin，ciprofloxacin，and were moderately sensitive to imipenem，but were resistance to doxycycline，tetracycline，sulphamethoxazole.

forest musk deer;Pseudomonasaeruginosa; isolation and identification; susceptibility

��(

)：

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.11.07

2016-04-13

四川省科技支撑计划项目(2014SZ0132)

郗立新(1991—)，男，陕西凤翔人，硕士研究生，研究方向为兽医微生物与免疫学。E-mail: 13547480554@163.com

*通信作者，颜其贵，E-mail: yanqigui@126.com

S855.1+2

A

1004-1524(2016)11-1847-06

浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis，2016，28(11): 1847-1852

http://www.zjnyxb.cn

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