应用高效液相色谱-二极管阵列检测器筛查中药及保健品中糖皮质激素类非法添加剂

徐巧玲，吴学军，姜文清，邝咏梅，金鹏飞，蔡小兵

(1.解放军第三○五医院，北京100017；2.北京医院药学部；3.中央军委联合参谋部警卫局卫生保健处)



应用高效液相色谱-二极管阵列检测器筛查中药及保健品中糖皮质激素类非法添加剂

徐巧玲1，吴学军2，姜文清2，邝咏梅2，金鹏飞2，蔡小兵3

(1.解放军第三○五医院，北京100017；2.北京医院药学部；3.中央军委联合参谋部警卫局卫生保健处)

目的 探讨应用高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)技术建立中药及保健品中非法添加氢化可的松琥珀酸钠、泼尼松龙、氢化可的松、泼尼松、甲泼尼龙、倍他米松、地塞米松、曲安奈德、醋酸泼尼松龙、醋酸氢化可的松、醋酸氟氢可的松、醋酸泼尼松、醋酸可的松、醋酸地塞米松、丁酸氢化可的松、醋酸曲安奈德、醋酸氟轻松和哈西奈德等18种糖皮质激素类添加剂成分的检查方法。方法 采用Alltima C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为乙腈-10 mmol/L醋酸铵二元梯度洗脱，流速为0.5 mL/min，检测波长242 nm。对于HPLC-DAD检出的疑似阳性样品用液相色谱-质谱法(LC-MS/MS)进行进一步确认。结果 氢化可的松和泼尼松的色谱峰重叠，其他16种糖皮质激素在5～320 mg/L内线性关系良好，线性相关系数(r)均大于0.9998；灵敏度高，最低检测限均在0.49～0.51 ng 之间，定量限均在1.23～1.27 ng之间；回收率良好，低、中、高3个浓度的回收率均在97.52%～104.2%之间；精密度良好，相对标准偏差(RSD)均小于0.47%；稳定性良好，12 h内峰面积和保留时间的相对标准偏差(RSD)均小于0.68%。14种不同剂型的样品通过HPLC-DAD检查和LC-MS/MS确认，结果显示：某片剂中检测出醋酸地塞米松，某喷雾剂中检出倍他米松。结论 HPLC-DAD技术应用快速、灵敏、易推广，可作为筛查药品及保健品中非法添加18种糖皮质激素的检查方法。

气相色谱-质谱法；糖皮质激素类；中草药；营养保健品

糖皮质激素是由肾上腺皮质最中层束状带分泌的一种代谢调节激素，具有调节糖、脂肪和蛋白质的生物合成和代谢的作用，临床上应用于内分泌代谢病、感染性疾病、血液病、心血管疾病、风湿免疫病、呼吸疾病等的治疗[1-2]。但不适当的使用可导致多种不良反应，引起代谢紊乱。一些中药制剂中非法添加糖皮质激素，使患者短期内病情得到改善，但会对健康造成严重威胁。目前，检测药品和保健品中糖皮质激素的方法主要有TLC法、HPLC法、LC-MS/MS法、UPLC-MS/MS法或几种方法的联用[3-17]，但检测的添加剂种类都在14种之内，不能涵盖常用的糖皮质激素药物种类。为更为快速、简便、广泛地检测中药和保健品中非法添加的糖皮质激素，本文采用HPLC-DAD快速筛查结合LC-MS/MS确认的方法建立了各类基质的中药和保健品中18种糖皮质激素类添加剂的检查方法。

1 仪器与试药

Agilent 1260 Infinity液相色谱分离系统(包括四元梯度泵、自动进样器和柱温箱)、Agilent 1260 二极管阵列检测器、OpenLAB工作站；Mettler XP -205 十万分之一电子天平(瑞士，梅特勒公司)；KQ—800KDE 型超声仪(昆山市超声仪器有限公司)；MilliQ 2150 型超纯水器。乙腈、四氢呋喃为色谱纯，醋酸铵为分析纯。

氢化可的松琥珀酸钠对照品(批号：100362-200501)、泼尼松龙对照品(批号：100153-199603)、氢化可的松对照品(批号：100152-200206)、泼尼松对照品(批号：100199-199401)、甲泼尼龙对照品(批号：100828-200501)、倍他米松对照品(批号：100118-200403)、地塞米松对照品(批号：100129-201105)、曲安奈德对照品(批号：100055-201103)、醋酸泼尼松龙对照品(批号：100124-200303)、醋酸氢化可的松对照品(批号：100013-200106)、醋酸氟氢可的松对照品(批号：100009-200704)、醋酸泼尼松对照品(批号：100012-200706)、醋酸可的松对照品(批号：100123-200303)、醋酸地塞米松对照品(批号：100122-200805)、丁酸氢化可的松对照品(批号：100303-200101)、醋酸曲安奈德对照品(批号：100125-200404)、醋酸氟轻松对照品(批号：100010-201108)和哈西奈德对照品(批号：100146-9502)均购自中国食品药品检定研究院。

检测样品：胶囊剂3种，其中国药准字2种，卫食健字1种；片剂6种，其中国药准字4种，国食健字1种，卫食健字1种；国药准字丸剂3种；国药准字口服液1种；进口注册的气雾剂1种。

2 方法

2.1 色谱条件 色谱柱：Alltima C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：10 mmol/L醋酸铵(A)—乙腈(B)二元梯度洗脱，洗脱程序见表1；流速：0.5 mL/min；进样量：20 μL。

表1 流动相梯度洗脱程序

2.2 混合储备液的制备 精密称取氢化可的松琥珀酸钠、泼尼松龙、氢化可的松、泼尼松、甲泼尼龙、倍他米松、地塞米松、曲安奈德、醋酸泼尼松龙、醋酸氢化可的松、醋酸氟氢可的松、醋酸泼尼松、醋酸可的松、醋酸地塞米松、丁酸氢化可的松、醋酸曲安奈德、醋酸氟轻松和哈西奈德对照品各约32 mg于50 mL量瓶中，加入甲醇30 mL溶解，加水定容至刻度，摇匀，即得。

2.3 混合对照液的制备 分别精密量取混合储备液适量，用60%甲醇溶液稀释成18种成分质量浓度分别约为5、10、20、40、80、160、320 mg/L的混合对照品溶液应用于考察氢化可的松琥珀酸钠、泼尼松龙、甲泼尼龙、倍他米松、地塞米松、曲安奈德、醋酸泼尼松龙、醋酸氢化可的松、醋酸氟氢可的松、醋酸泼尼松、醋酸可的松、醋酸地塞米松、丁酸氢化可的松、醋酸曲安奈德、醋酸氟轻松和哈西奈德等16种成分的线性。其中质量浓度约为40 mg/L的混合对照品溶液作为混合对照品工作液用于系统适应性研究和实际样品的筛查。

2.4 供试品溶液的制备 胶囊剂：取内容物10粒，研细，混匀，精密称取约一次服用量，置50 mL量瓶中，加入甲醇30 mL，震荡1 min使分散，超声15 min，加水定容至刻度，摇匀，即得。口服液：取5支口服液混匀，精密量取1支量于50 mL量瓶中，加入甲醇30 mL，加水定容至刻度，摇匀，即得。丸剂：将丸剂压扁至薄片状，先用剪刀剪成细条进而剪成粒状，研细，精密称取约2 g，置50 mL量瓶中，加入甲醇30 mL，震荡1 min使分散，超声25 min(部分不易分散样品可浸泡过夜并增加超声时间)，加水定容至刻度，摇匀，即得。片剂：取10片，研细，混匀，精密称取约一次服用量，置50 mL量瓶中，加入甲醇30 mL，震荡1 min使分散，超声15 min，加水定容至刻度，摇匀，即得。气雾剂：精密量取喷出液体10 mL到50 mL量瓶中，加入甲醇20 mL，加水定容至刻度，摇匀，即得。所有供试品溶液进样前，都用0.22 μm 孔径微孔滤膜滤过。

2.5 样品的检测及判定

2.5.1 18种糖皮质激素的初筛 分别对混合对照品工作液和供试品溶液进样分析，通过综合比对供试品溶液和混合对照品工作液中色谱峰的保留时间和紫外图谱初步判定可疑样品。

2.5.2 加标实验 “2.5.1”中判定为可疑的样品中加入适量疑似添加成分的对照品溶液，考察样品和对照品色谱峰是否完全重合、紫外图谱是否有变化，如色谱峰完全重合且紫外图谱未见变化则初步判定为阳性样品。配制和阳性样品中检出成分峰面积接近的对照品溶液，外标法计算阳性样品中检出成分的含量。

2.5.3 质谱确认 对初步判定为阳性的样品在同等的色谱条件下用LC-MS/MS进行确认，对比色谱峰质谱图和标准品质谱图的相似性，相似性大于70%的判定为阳性样品。

2.6 阴性空白溶液的制备 将不含上述18种糖皮质激素的某国药准字镇痛中成药按照“2.4”的方法制备得到的供试品溶液作为阴性空白溶液。

3 结果

3.1 方法选择性 分别考察了混合对照品工作液、阴性空白溶液和供试品溶液的色谱图。结果显示：阴性空白样品的主要色谱峰都在9 min之前，不干扰18种糖皮质激素的筛查。典型色谱图见图1。氢化可的松和泼尼松的色谱峰完全重合，对于这两种成分的疑似阳性样品只能通过LC-MS/MS进行确认。

3.2 系统适应性，最低检测限、定量限和线性 混合对照品工作液连续进样6次，考察除氢化可的松和泼尼松外16种成分色谱峰的理论塔板数、对称因子和分离度。将对照品溶液逐级稀释，以信噪比(S/N)约为3.0时的浓度为各成分的最低检测限，信噪比(S/N)约为10.0时的浓度为各成分的定量限。以各成分的质量浓度(mg/L)为横坐标，峰面积为纵坐标，在5～320 mg/L内进行线性考察。结果(表2)显示：16种成分的理论塔板数均大于10 000，对称因子均在0.76～1.01之间，分离度均大于1.3，表明方法具有良好的系统适应性；线性相关系数均在0.9999～1.0000之间，表明方法具有良好的线性；最低检测限均在0.49～0.51 ng 之间，定量限均在1.23～1.27 ng之间，表明方法具有良好的灵敏度。

注：混合对照品工作液(A)、阴性空白溶液(B)、醋酸地塞米松阳性样品(C)和醋酸地塞米松阳性样品+醋酸地塞米松(D)的典型色谱图。1.氢化可的松琥珀酸钠;2.泼尼松龙;3.氢化可的松;4.泼尼松;5.甲泼尼龙;6.倍他米松;7.地塞米松;8.曲安奈德 ;9.醋酸泼尼松龙;10.醋酸氢化可的松;11.醋酸氟氢可的松;12.醋酸泼尼松;13.醋酸可的松;14.醋酸地塞米松 ;15.丁酸氢化可的松;16.醋酸曲安奈德;17.醋酸氟轻松;18.哈西奈德

图1 混合对照品工作液、阴性空白溶液和供试品溶液的典型色谱图

3.3 回收率、精密度和稳定性 取约相当于一次服用量的阴性空白样品18份，置于50 mL量瓶中，分别精密加入混合对照品储备液(640 mg/L)、混合对照品溶液(160 mg/L)、混合对照品溶液(40 mg/L)各12.5 mL，按照“2.4”项下规定，用60%甲醇制备供试品溶液，每个浓度水平分别制备6份，进样分析，以峰面积代入标准曲线计算测得量，以测得量和加入量的比值作为方法回收率，以比值的RSD作为方法精密度。结果(见表3)显示：低、中、高加样浓度下，16种成分回收率均在97.5%～104.2% 之间，RSD均小于0.46%，表明方法回收率和精密度良好。另取低、中、高3种浓度的溶液分别于0、2、4、6、12 h进样分析，18种成分色谱峰峰面积的RSD(n=5)均小于0.68%，色谱峰保留时间的RSD(n=5)均小于0.35%，表明12 h内方法稳定性良好。

3.4 实际样品筛查 应用本实验建立的方法对14种中药制及保健品进行了18种糖皮质激素的筛查。在一种标注国药准字号的抗炎片剂中检测到了保留时间和紫外图谱与醋酸地塞米松完全一致的色谱峰，加标实验中该色谱峰和醋酸地塞米松色谱峰也完全重复(见图1)，LC-MS/MS确认该色谱峰和醋酸地塞米松对照品的质谱相似度大于70%，因而判定为醋酸地塞米松阳性样品，含量为128.1 微克/片。同法判定另一种标注进口注册号的抗炎气雾剂为倍他米松阳性样品，含量为13.57 μg/mL。其他样品中未检出上述18种糖皮质激素。

4 讨论

4.1 流动相的选择 实验过程中考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-甲醇-水、乙腈-磷酸二氢铵、甲醇-磷酸二氢铵、乙腈-醋酸铵、甲醇-醋酸铵等多个流动相系统，结果发现乙腈-磷酸二氢铵系统和乙腈-醋酸铵系统的分离度较好，但考虑到乙腈-醋酸铵系统可作为质谱的流动相，有利于进一步的确认，因而选择乙腈-醋酸铵系统作为流动相。在对醋酸铵缓冲液的pH值和浓度的优化中发现：10 mM醋酸铵溶液用氨水调至pH7.5的分离效果最佳，但由于该溶液中的氨易挥发，存放过程中易出现pH下降的情况，影响保留时间的稳定性。直接使用10 mM醋酸铵溶液配制更为方便，稳定性更好，分离度虽稍差，但也均大于1.3，能满足筛查的需要。但在上述各种色谱条件下，泼尼松和氢化可的松仍无法分离，下一步需要进一步优化色谱条件实现2种成分的完全分离。

4.2 检测波长的选择 18种糖皮质激素化学结构类似，其紫外最大吸收峰均在239～247 nm范围内，故选择242 nm作为最终的检测波长。

4.3 样品提取方法的选择 18种糖皮质激素在甲醇中的溶解度很好，易于提取，但峰形很差。本实验采用60%甲醇溶液进行提取，有效地改善了峰形。超声优化中发现，不同的剂型所需的时间不同，一般制剂15 min就能完全提取，有些丸剂则需要25 min甚至更长时间。

4.4 样品筛查的注意点 该色谱系统下，用HPLC-DAD进行检查时，所有糖皮质激素的出峰时间都在9～60 min内，而绝大多数中药本身含有的化学成分多集中在9 min之前出峰，很容易从保留时间上和添加的糖皮质激素进行区分，对于个别9 min后仍集中出峰的样品，可适当调整乙腈-缓冲液比例和各梯度水平的保持时间等梯度参数。

5 结论

本实验建立的检查方法具有快速、灵敏、易推广的特点，可应用于中药和保健品中非法添加氢化可的松琥珀酸钠、泼尼松龙、氢化可的松、泼尼松、甲泼尼龙、倍他米松、地塞米松、曲安奈德、醋酸泼尼松龙、醋酸氢化可的松、醋酸氟氢可的松、醋酸泼尼松、醋酸可的松、醋酸地塞米松、丁酸氢化可的松、醋酸曲安奈德、醋酸氟轻松和哈西奈德的筛查。对于不具备LC-MS/MS的单位，仅凭本文建立的HPLC-DAD法也可初步实现对中药和保健品中上述18种糖皮质激素的筛查。

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Detection of glucocorticoids illegally adulterated into traditional chinese medicines and health foods by HPLC-DAD

XuQiaoling*,WuXuejun,JiangWenqing,KuangYongmei,JinPengfei,CaiXiaobing

(*The305thHospitalofthePLAofChina,Beijing100017,China)

CaiXiaobing，Email：caixiaobing5757@hotmail.com

Objective To detect 18 glucocorticoids (hydrocortisone sodium succinate,prednisolone,hydrocortisone,prednisone,methylprednisolone,betamethasone,dexamethasone,triamcinolone acetonide,prednisolone acetate,hydrocortisone,fludrocortisone acetate,prednisone acetate,cortisone acetate,dexamethasone acetate,hydrocortisone butyrate,triamcinolone acetonide acetate,fluocinonide,halcinonide) illegally adultered into Traditional Chinese Medicines and health foods by establish an HPLC-DAD method.Methods An Alltima C18column(4.6 mm×250 mm，5 μm)was used for the separations,The mobile phase were consisted of acetonitrile - 10 mmol/L ammonium acetate solution by gradient elution.The flow rate was 0.5 mL/min.The column temperature was 30 °C.The detection wavelength was 242 nm,Suspicious samples were confirmed by LC-MS/MS.Results The peaks of hydrocortisone and prednisone were overlapped,the linearity and sensitivity for other 16 glucocorticoids were fine with all correlation coeffcients (r) bigger than 0.9998 and all LODs between 0.49～0.51 ng,The spiked recoveries of low,middle and high levels ranged from 97.5% to 104.2%;the precisions were satisfactory with all RSDs<0.47%；the stability within 12h was acceptable with the RSDs of peak areas and retention times no more than 0.68% and 0.35%,Fourteen Traditional Chinese Medicines and health foods were test by HPLC-DAD and LC-MS/MS,and the result showed:dexamethasone acetate was found in a tablet sample,while betamethasone was found in a spray sample.Conclusion HPLC-DAD is fast and sensitive method for the detection of 18 glucocorticoids illegally adulterated into Traditional Chinese Medicines and health foods.

Mass spectrometry；Glucocorticoids；Drugs,Chinese herbal；Dietary supplements

中央保健科研课题专项资金(B2009B032)

徐巧玲，副主任药师，Email：xuqiaoling305@163.com

蔡小兵，主任药师，Email：caixiaobing5757@hotmail.com

R35-33

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2016.06.003

2016-07-11)