基于NYT 1433-2014中48对SSR引物的94份杂交稻亲本DNA分子数字指纹库研究

林亦霞 王梓辛 刘欢 王征 梁满中 戴小军 陈良碧

(湖南师范大学 生命科学学院， 长沙 410081； *通讯联系人， E-mail: hello_dxj@163.com， chenliangbi@126.com)



基于NYT 1433-2014中48对SSR引物的94份杂交稻亲本DNA分子数字指纹库研究

林亦霞 王梓辛 刘欢 王征 梁满中 戴小军*陈良碧*

(湖南师范大学 生命科学学院， 长沙 410081；*通讯联系人， E-mail: hello_dxj@163.com， chenliangbi@126.com)

LIN Yixia, WANG Zixin, LIU Huan, et al. Research on DNA molecular digital fingerprint database based on 48 pairs of SSR primers for 94 hybrid rice parents in NYT 1433-2014. Chin J Rice Sci, 2016, 30(6): 593-602.

建立方法简便、分辨率高的水稻品种遗传多态性和真实性鉴定的分子指纹技术对于指导水稻育种和规范种子市场都具有重要意义。农业部颁布的水稻品种鉴定技术规程行业新标准是基于35个不同遗传特点的代表性水稻品种建立的SSR分子标记技术规程。本研究根据该标准方法，对94份杂交水稻亲本材料的遗传多态性和特异性进行了比较分析，结果表明，供试品种间至少具有3对以上引物扩增的DNA片段差异，即利用该标准能很好地区分供试杂交水稻亲本的遗传差异。对新标准中48对推荐引物的比较与分析表明，46对引物扩增的DNA片段多态性较高，而RM176和RM551两对引物扩增带多态性较低，因此在其染色体的其他位点可进一步研究多态性更高的分子标记。与标准中35个水稻品种的指纹库进行比较，发现了16个新的等位变异，这些位点可作为标准指纹库的信息补充，丰富标准库中的遗传信息。对94个杂交水稻亲本的分子指纹比较分析，发现23个亲本材料具有特异性分子标记，这些特异分子标记可应用于杂交组合的真实性以及杂交种子纯度的分子鉴定。根据供试亲本的数字分子指纹，构建了87个不育系与7个父本杂交的虚拟组合数字分子指纹库以及虚拟组合的真实性和纯度快速鉴定的特异数字分子标记。

杂交稻； SSR引物； 数字指纹

SSR分子标记是共显性标记，多态性丰富，具有操作简便快捷和稳定性好等特点[1]，已广泛应用于遗传图谱的构建和遗传多样性分析等[2-3]。越来越多的研究表明SSR分子标记技术在水稻品种真伪及纯度鉴定上显示出了巨大的作用，具有无可比拟的优势[4-10]。

2007年以前，利用SSR标记建立水稻分子指纹库已有大量研究，但没有得到行业普遍认可的标准。2007年农业部颁发了水稻真实性鉴定标准“水稻品种鉴定DNA指纹方法(NY/T1433-2007)”，但该标准所用SSR标记仅24对，且部分标记多态性不高，在鉴定品种真实性中存在局限性。2014年农业部重新发布了新修订的行业新标准“水稻品种鉴定技术规程 SSR标记法(NY/T 1433-2014)”，该标准利用35个不同遗传特点的代表性水稻品种筛选出了多态性较高的48对引物作为SSR核心标记，并对每对SSR标记标注了其常见等位变异和每个等位变异的bp值，弥补了旧标准的不足，为建立水稻数字分子指纹库奠定基础，为我国水稻新品种的审定以及新品种的分子遗传多态性评价提供了重要的技术支持。

杂交水稻的大面积推广应用为提高我国粮食产量做出了重大贡献。杂交水稻亲本的遗传多态性是培育不同杂交组合的遗传基础，根据农业部水稻品种鉴定技术规程行业新标准，申请审定的杂交水稻新组合在以48对SSR引物构建的DNA分子指纹图谱中，必须与其他已有品种具有不少于2个标记差异。因此，开展杂交水稻亲本以及亲本选育材料的分子遗传多态性分析，对于杂交水稻育种具有重要指导作用。另外，以48对引物为基础，开发更多的特异DNA片段，对于丰富水稻分子指纹数据库以及开展杂交种子纯度的快速分子鉴定都有重要意义。本研究以两系和三系杂交稻亲本为研究材料，构建数字分子指纹库，分析其遗传多态性和特异性，以期为杂交水稻选育和种子质量评价等提供技术支持[11-15]。

1 材料与方法

1.1 水稻材料

94个杂交水稻亲本中包括籼稻温敏不育系54个，来源于光敏不育系农垦58S不育基因源的粳稻不育系2个，籼稻不育系3个，三系野败型不育系17个， 印尼型不育系3个， 冈型不育系1个， 辽型不育系2个， 马协型不育系1个，红莲型不育系2个， BT型不育系2个，父本材料7个(表1)。

1.2 实验方法

1.2.1 水稻DNA的提取

水稻叶片(或种子)按照CTAB法提取幼苗叶片DNA。

1.2.2 PCR扩增和凝胶电泳

根据农业行业标准(NY/T 1433-2014)推荐的48对SSR核心标记物序列，由上海生工公司合成PCR引物。SSR反应在10 μL的反应体系中进行，其中包括2×TaqPCR Mix 5 μL，ddH2O 3 μL，引物(20 μmol/L) 各0.5 μL，模板DNA(50 ng/μL) 1 μL。 扩增条件为94℃下预变性 4 min； 94℃下变性45 s， 55℃下退火45 s， 72℃下延伸1 min,35个循环；最终72℃下延伸8 min。PCR扩增产物和参照品种一起在8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后进行观察记录分析。

1.2.3 数据赋值及数据库建立

根据各标记的标准样品，对各水稻材料的电泳条带结果进行赋值: 纯合位点的基因型数据记录为X/X，X为该位点等位变异的大小；杂合位点的基因型数据记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异，小片段数据在前，大片段数据在后。缺失位点等位变异数据记录为0/0。根据以上数据重复性验证后对水稻各品种建立分子指纹数据库。

1.2.4 新片段克隆测序

对扩增出的农业部标准提供的指纹库中不存在的新带型的片段重复验证后进行切胶回收，回收产物连接到载体PMD-18T，转化后对菌落进行PCR检测并测序。

2 结果与分析

2.1 杂交水稻亲本数字分子指纹库与遗传多样性分析

根据农业行业标准(NY/T 1433-2014)的48对SSR引物和35个代表性品种作为参照品种，构建供试杂交水稻亲本材料数字分子指纹库。图1为水稻不育系品种“准S”的扩增结果，图1-A为引物RM85扩增图谱，参照品种齐粒丝苗(104 bp)、安育早1号(95 bp)、紫香糯(80 bp)各有1条带，准S扩增出的条带与参照品种齐粒丝苗扩增带一致，准S该位点的数字分子赋值为104/104。图1-B为引物OSR28扩增图谱，5个参照品种分别是合江18(178 bp)、旱轮稻(172 bp)、红壳老来青(169 bp)、Dasanbyeo(135 bp)、竹云糯(132 bp)，准S扩增的条带与参照品种Dasanbyeo一致，即准S该位点的数字分子赋值为135/135。

表1 供试的94个杂交稻亲本的名称与代号

Table 1. Name and code of 94 tested hybrid rice parents.

代号Code材料Material类型Type代号Code材料Material类型Type1陆18SLu18ST48BYXX1T2长选3SChangxuan3SPT49BYXX2T3农垦58SNongken58SP50BYXX3T4广占63SGuangzhan63ST51BYXX4T5准SZhunST52BYXX5T6安农S-1AnnongS-1T53BYXX6T7901ST54BYXX7T8湘陵628SXiangling628ST55BYXX8T9B101ST56BYXX9T10广湘24SGuangxiang24ST577001SP11株1SZhu1ST58N5088SP121103ST59PA64SPT13BY58ST60V20AWA14T91S-选T91S-chosenT61丰源AFengyuanAWA15D40ST62T98AWA16GS6T63五丰AWufengAWA17荆18SJing18ST64634AWA18隆605SLong605ST65天丰ATianfengAWA19永早3SYongzao3ST66D62AWA20香125SXiang125ST67川香29AChuanxiangAWA21贺1SHe1ST68宜香AYixiangAWA22N111ST69优ZAYouZAWA23标810SBiao810ST70炳1ABing1AWA24T91ST71岳4AYue4AWA25恒59SHeng59ST72贺11AHe11AWA26早SZaoST73隆398ALong398AWA27810ST74吉天AJitianAWA28N118ST75隆晶4302ALongjing4302AWA29YOST76深95AShen95AWA30H638ST77Ⅱ32AIA3188ST78优1AYou1AIA32710ST79中九AZhongjiuAIA33安湘SAnxiangST80冈46AGang46AGA34750ST8124-64AL35株25SZhu25ST82H13AL36H629ST83武香AWuxiangAM37Y58ST84粤泰AYuetaiAHL38明SMingST85超泰AChaotaiAHL39隆74SLong74ST86T1ABT40KT27ST87199ABT41华煜4127SHuayu4127ST889311F42锦4128SJin4128ST899311-选9311-chosenF43云峰SYunfengST90R527F44天安STiananST91R111F45N2ST92R58F46衡农SHengnongST93R624F47W6154SPT94R217F

T-温敏不育系; P-来源于农垦58S的粳稻光敏不育系; PT-来源于农垦58S的籼稻温敏不育系; WA-野败型不育系; IA-印水型不育系; GA-冈型不育系; HL-红莲型不育系; L-辽型不育系; M-马协型不育系; F-父本材料。 9311-有芒9311; 9311-选-无芒9311; BYXX1～BYXX9为新选育未审定的两用核不育系。

T, Thermo-sensitive genetic male sterile line; P,japonicamale sterile line derived from Nongken 58S; PT,indicamale sterile line derived from Nongken 58S; WA, Wild abortion type sterile line; IA, Cytoplasmic male sterile line; GA, Type-G CMS line; HL, HL-type CMS line; L, Liao-type CMS line; M, Maxie-type CMS line; F, Male parent. 9311, Awned 9311. 9311-chosen, Awnless 9311； BYXX1-BYXX9, New genic male sterile lines before examination.

1-紫香糯; 2-安育早1号; 3-齐粒丝苗; 4-天安S； 5-竹云糯； 6-Dasanbyeo; 7-红壳老来青; 8-旱轮稻; 9-合江18。A-SSR引物RM85; B-SSR引物OSR28。

1, Zixiangnuo; 2, Anyuzao 1; 3, Qilisimiao; 4, Tian′an S； 5, Zhuyunnuo； 6, Dasanbyeo; 7, Hongkelaolaiqing; 8, Hanlundao; 9, Hejiang 18. A， SSR primer RM85; B, SSR primer OSR28.

图1 准S上SSR标记RM85和OSR28扩增电泳结果

Fig.1. Electrophoretogram amplified with RM85 and OSR28 in Zhun S.

将48对引物的准S扩增片段大小进行统计和赋值，该品种的数字分子指纹结果见表2。对94个杂交稻亲本按照此种方式进行赋值，建立数字分子指纹库。

利用软件NTSYS-PC对94个杂交水稻亲本的遗传相似系数进行分析(表3)，各品种间遗传相似系数变幅0.54～0.97，其中遗传相似系数最高的两个品种是标810S和810S，标810S是810S的自然突变体，其遗传相似系数高达0.97，这两个品种有3对引物的差异，其中2对引物的差异为扩增条带有或无，1对引物为扩增条带迁移率不同。遗传相似系数最低的是陆18S和H13A，仅为0.54。两个品种间有40对引物的差异，陆18S是早籼型温敏核不育系，H13A是粳稻辽型细胞质雄性不育系，亲缘关系远，遗传差异大。根据品种间差异的引物数不少于2对判定为“不同品种”的标准，94个杂交水稻亲本都为不同品种。该研究结果表明新标准的48对SSR标记具较强的核DNA多态性区分功能。

2.2 48对SSR分子标记的多态性比较

DNA分子标记的多态性是衡量该标记有效性的重要标志。供试的48对SSR引物在94个杂交水稻亲本中共检测到197个等位变异。每对引物扩增的等位变异范围为2～7个，平均值为4.10，PIC范围为0.25～0.77，平均值为0.56(表4)，具较高多态性。

表2 准S核DNA数字分子指纹

Table 2. Results of digital molecular fingerprint of Zhun S nuclear DNA.

序号No.引物Primer基因型Genotype/bp序号No.引物Primer基因型Genotype/bp序号No.引物Primer基因型Genotype/bp1RM583189/18917RM267156/15633OSR28135/1352RM71148/14818RM253142/14234RM590139/1393RM85104/10419RM481162/16235RM21160/1604RM471104/10420RM339146/14636RM3331120/1205RM274162/16221RM278142/14237RM443119/1196RM190109/10922RM258128/12838RM49092/927RM336154/15423RM224155/15539RM424263/2638RM72163/16324RM17185/18540RM423268/2689RM219222/22225RM493237/23741RM571179/17910RM311170/17026RM561185/18542RM231180/18011RM209132/13227RM8277165/16543RM567248/24812RM19216/21628RM551184/18444RM289106/10613RM1195146/14629RM598156/15645RM54289/8914RM208180/18030RM176136/13646RM316196/19615RM232141/14131RM432168/16847RM332167/16716RM119169/16932RM331171/17148RM7102173/173

表3 供试94个杂交水稻亲本的遗传相似系数比较

Table 3. Genetic similarity coefficient comparison of the tested 94 hybrid rice parents.

材料Material遗传相似系数Geneticsimilaritycoefficient区间Range平均值Mean材料Material遗传相似系数Geneticsimilaritycoefficient区间Range平均值Mean陆18SLu18S0.54-0.890.71BYXX10.65-0.810.68长选3SChangxuan3S0.61-0.820.69BYXX20.64-0.810.72农垦58SNongken58S0.55-0.880.62BYXX30.59-0.830.79广占63SGuangzhan63S0.56-0.830.69BYXX40.59-0.840.71准SZhunS0.55-0.820.73BYXX50.57-0.840.70安农S-1AnnongS-10.60-0.770.69BYXX60.60-0.840.69901S0.60-0.960.72BYXX70.61-0.800.70湘陵628SXiangling628S0.60-0.960.68BYXX80.58-0.840.70B101S0.61-0.790.69BYXX90.59-0.800.71广湘24SGuangxiang24S0.56-0.790.687001S0.58-0.880.63株1SZhu1S0.55-0.800.70N5088S0.57-0.860.641103S0.63-0.800.72PA64S0.58-0.770.69BY58S0.60-0.750.68V20A0.62-0.840.71T91S-选T91S-chosen0.61-0.800.69丰源AFengyuanA0.61-0.850.72D40S0.57-0.890.70T98A0.62-0.820.71GS60.56-0.890.69五丰AWufengA0.61-0.930.73荆18SJing18S0.56-0.930.69634A0.63-0.880.72隆605SLong605S0.58-0.930.70天丰ATianfengA0.61-0.880.72永早3SYongzao3S0.55-0.900.70D62A0.60-0.840.71香125SXiang125S0.56-0.900.70川香29AChuanxiangA0.55-0.820.72贺1SHe1S0.59-0.830.70宜香AYixiangA0.66-0.850.72N111S0.64-0.760.69优ZAYouZA0.65-0.890.73标810SBiao810S0.62-0.970.71炳1ABing1A0.57-0.890.72T91S0.55-0.820.71岳4AYue4A0.60-0.850.72恒59SHeng59S0.63-0.770.70贺11AHe11A0.54-0.770.68早SZaoS0.59-0.830.71隆398ALong398A0.59-0.790.70810S0.61-0.970.70吉天AJitianA0.58-0.800.69N118S0.59-0.860.70隆晶4302ALongjing4302A0.56-0.820.70YOS0.61-0.800.70深95AShen95A0.65-0.820.73H638S0.64-0.910.71Ⅱ32A0.60-0.890.7388S0.63-0.830.70优1AYou1A0.61-0.840.71710S0.61-0.860.71中九AZhongjiuA0.61-0.800.70安湘SAnxiangS0.61-0.850.71冈46AGang46A0.60-0.890.73750S0.59-0.860.7224-64A0.57-0.820.64株25SZhu25S0.60-0.860.70H13A0.54-0.800.63H629S0.59-0.910.71武香AWuxiangA0.62-0.770.68Y58S0.60-0.790.68粤泰AYuetaiA0.62-0.850.73明SMingS0.58-0.820.70超泰AChaotaiA0.58-0.750.69隆74SLong74S0.59-0.750.68T1A0.55-0.800.63KT27S0.57-0.760.68199A0.56-0.800.63华煜4127SHuayu4127S0.62-0.930.6993110.61-0.820.73锦4128SJin4128S0.56-0.920.719311-选9311-chosen0.61-0.820.69云峰SYunfengS0.57-0.850.71R5270.62-0.810.70天安STiananS0.58-0.850.70R1110.60-0.830.66N2S0.59-0.780.71R580.62-0.870.69衡农SHengnongS0.59-0.790.72R6240.61-0.820.69W6154S0.58-0.790.71R2170.61-0.870.69

表 4 48对分子标记在供试杂交水稻亲本中等位基因数及多态性信息指数比较

Table 4. Number of alleles and PIC for the test hybrid rice parents of 48 SSR molecular markers.

引物Primer等位基因数No.ofalleles多态性信息量PIC引物Primer等位基因数No.ofalleles多态性信息量PIC引物Primer等位基因数No.ofalleles多态性信息量PICRM58350.68RM26730.58OSR2850.46RM7130.51RM25340.57RM59030.59RM8540.39RM48150.55RM2170.75RM47130.53RM33930.41RM333160.77RM27420.35RM27840.66RM44330.30RM19050.58RM25840.60RM49040.47RM33670.69RM22470.75RM42440.64RM7270.60RM1720.46RM42330.47RM21960.70RM49350.64RM57130.54RM31140.60RM56140.29RM23140.66RM20950.70RM827760.39RM56730.38RM1950.68RM55130.25RM28920.37RM119560.75RM59830.63RM54230.35RM20850.67RM17620.26RM31640.70RM23250.71RM43240.75RM33240.54RM11920.76RM33120.46RM710240.69平均值Mean4.100.56

引物RM224等位基因数为7，扩增出15种带型，其PIC值高达0.75，另一对引物RM119，等位基因数为2，虽只扩增出2种带型，其PIC值高达0.76。表明这两个标记位点呈高度多态性。而第6染色体标记引物RM176等位基因数为2，只有2种带型，其PIC值仅为0.26，该标记在供试材料的遗传差异分析中贡献率最大不超过10%。第4染色体上标记引物RM551等位基因数为3，扩增出3种带型，但PIC值也仅0.25。该标记在供试材料的遗传差异分析中贡献率最大不超过7%。表明这两个标记位点多态性不高，对品种间的差异分辨力弱。

2.3 杂交水稻亲本中新增等位变异位的分析

与35个参照水稻品种构建的分子指纹库进行比对，在供试的杂交水稻亲本中的有13对SSR引物扩增出了16条新条带。例如引物RM231在安农S-1中扩增出了一条比参照品种轮回01(194 bp)、合江18(192 bp)、陆川早1号(186 bp)小的条带(图2)，经克隆测序该新带长度为180 bp。其全序列为CCAGATTATTTCCTGAGGTCAAGGGCTTTGAGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTAAAAAAGATCTGTTTGTATTTCATTGCAATACATGTAGTTATCAGTAATAACAGAAAGAACATTTGTACATTACTCTCAATCACTACATTTTTTTTCAATGCAGAACTATGCAAGTGA。除在安农S-1外，在准S、KT27S等13个材料中都扩增出了该条带，且序列完全一致。

1-陆川早1号； 2-合江18； 3-轮回01； 4-安农S-1。

1, Luchuanzao 1; 2, Hejiang 18; 3, Lunhui 01; 4, Annong S-1.

图2 引物RM231在安农S-1中扩增出的新条带

Fig. 2. New band amplified with primer RM231 of Annong S-1.

引物RM72扩增出了两条新带，其中在R527、R58等9个水稻材料中扩增出的新条带为165 bp的新片段，全序列为CCGGCGATAAAACAATGAGAAATTAGGTACATAATAATAATAATAGTAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAGTAATAATAATAGTAATAGTAATAATAAAAGCATAAATAACTTGCAACCCATATCCCTTAGTTAGGACCGATGCA。在长选3S、明S等7个材料中扩增出的新条带为152 bp，全序列为GCATCGGTCCTAACTAAGGGATATGGGTTGCAAGTTATTTATGCTTTTATTATTACTATTACTATTATTATTACTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTACTATTATTATTATTATGTACCTAATTTCTCATTGTTTTATCGCCGG。

表5 杂交水稻亲本新增等位变异位点及片段大小

Table 5. New allelic variants point and fragment size of hybrid rice parents.

序号No.引物Primer参照品种等位变异点Commonallelicvariationpoint/bp新增等位变异点Newallelicvariationpoint材料名称Material1RM583180,189,192,1951589311,9311-选2RM8580,95,10493荆18S,隆605S,广占63S,天安S3RM190109,120,122128YOS4RM190109,120,122107B101S,BY58S,T91S-选5RM72163,175,178,190,193152长选3S,PA64S,明S,N111S,YOS,H638S,H629S6RM72163,175,178,190,193165华煜4127S,R527,R111,R58,R624,R217,恒59S,901S7RM219194,200,202,215,222186安农S,明S,N118S,标810S,安湘S,株25S8RM19216,247,250,253221贺1S,N111S9RM253133,135,142119隆74S,BYXX6,超泰A10RM481146,162,165182云峰S,荆18S,R111,D40S11RM481146,162,165156隆74S12RM432168,172,188180云峰S,天安S,华煜4127S,锦4128S,KT27S,隆398A,陆18S,广占63S,贺11A,GS6,隆605S,N111S,标810S,810S,N118S,H638S,88S,750S,H629S,931113RM49092,97,99108陆18S,GS6,永早3S14RM231186,192,194180锦4128S,KT27S,准S,安农S,BYXX7,永早3S,标810S,810S,H638S,H629S,岳4A,901S15RM332162,164,167184陆18S,GS6,T91S,W6154S,株25S16RM336151,154,160,163,166,193144宜香A,24-64A

另外RM190、RM481等8对引物扩增出的新条带只出现在1～3份材料中(表4)，例如引物RM190在不育系YOS中扩增出了1条128 bp特异带。引物RM481在隆74S中扩增出了1条156 bp特异带。引物RM583在父本9311和9311-选中扩增出了1条158 bp特异带。这种特异位点可用于杂交水稻亲本以及组合的真实性和纯度的快速分子检测。

2.4 虚拟杂交组合数字分子指纹库及特异分子标记

杂交组合包含了双亲的全部遗传信息，杂交组合核DNA的数字分子指纹即父母本的互补数字分子指纹，根据已知的杂交水稻亲本的数字分子指纹，可虚拟出杂交组合的数字分子指纹。

例如，根据 YOS和9311的数字分子指纹，虚拟出了YOS/9311的杂交组合数字分子指纹(表5)。该数字分子指纹与另外86个不育系杂9311的组合以及YOS杂另6个父本的组合的数字分子指纹都具有3对以上的差异位点，故该虚拟组合符合新品种遗传审定标准。在该虚拟组合生产应用中，引物RM583扩增出的158 bp/189 bp可作为杂交组合真实性和纯度分子快速检测标记，即杂交组合种子中只有189 bp条带的为混杂种子，混杂来源于不育系自交种子；只有158 bp条带的也为混杂种子，混杂来源于父本的机械混杂；具有xxxbp/189 bp或189 bp/xxxbp条带为串粉混杂种子；不含158 bp和189 bp条带的种子为稻田落粒谷混杂或其他机械混杂种子。

3 讨论

目前中国在杂交稻品种选育方面正快速形成育繁推一体化的品种创新体系，杂交稻亲本选育必将进入快速发展时期，但现代分子生物学技术在杂交育种中的贡献率仍较低，加强分子技术与传统育种技术的紧密结合已成为杂交水稻育种的迫切需求[16-19]。开展杂交水稻亲本选育过程中核DNA数字分子指纹分析，是加速新品种选育的有效途径，即对新选育材料进行DNA数字分子指纹分析，并将数字信息提交到数据库进行比对，以具2对以上变异位点作为筛选标准，只有达到该标准的亲本材料应用于杂种优势测配，这样有利于减少杂交稻亲本选育的盲目性和大量无效测配劳动，提高杂交育种效率[20-23]。

表6 YOS /9311杂交组合数字分子指纹

Table 6. Results of digital molecular fingerprint of YOS /9311 hybrids.

序号No.引物Primer基因型Genotype/bp序号No.引物Primer基因型Genotype/bp序号No.引物Primer基因型Genotype/bp1RM583189/18917RM267156/15633OSR28135/1352RM71139/14818RM253142/14234RM590139/1463RM85104/10419RM481162/16535RM21128/1384RM471102/10420RM339146/14636RM3331110/1105RM274149/16221RM278128/13837RM443119/1236RM190122/12822RM258128/13238RM49092/927RM336154/15423RM224153/15339RM424280/2808RM72152/15224RM17159/18540RM423268/2719RM219202/21525RM493237/24041RM571179/18510RM311170/17026RM561185/18742RM231192/19211RM209132/13227RM8277165/16543RM567248/24812RM19247/24728RM551184/19044RM28987/10613RM1195142/14629RM598153/15645RM54289/8914RM208167/18230RM176136/13646RM316200/20015RM232150/16131RM432168/18847RM332164/16416RM119169/16932RM331151/17148RM7102170/190

目前，杂交水稻市场的品种套牌、冒牌等侵权事件时有发生，建立不同品种的数字分子指纹库是解决这一问题的有效手段[24-25]。前期许多研究建立的水稻品种分子指纹图谱，主要依据条带的多少进行比对，不能数字化，加之没有参照品种作对照，不同实验条件下其电泳带的迁移率不尽相同，导致分子指纹图谱的相似性分析易出现偏差，另外前期的24对标准引物信息量偏少，部分引物多态性不高，导致水稻品种的分子指纹特异性不高[26-29]。利用农业部行业新标准(NY/T 1433-2014)易于构建杂交水稻亲本以及组合特异的数字分子指纹，更有利于水稻品种的产权保护。

本研究也发现新标准中标记引物RM176和RM551作为分子标记的多态性不高，对不同品种的分辨力较弱，有必要在其染色体上开发新的分子标记。本研究同时筛选到16个新的等位变异位，这些位点可作为标准指纹库的信息补充，丰富标准库中的遗传信息。

SSR标记在单个座位上检测到的多态性远高于其他几种分子标记，且广泛随机均匀地分布于整个基因组，能准确高效地鉴别大量等位基因，利用父母本特异互补带可作为快速鉴定品种真实性和纯度的理想分子标记[30-35]。本研究在杂交水稻亲本材料中筛选出23份材料的特异分子标记，这些特异分子标记可作为杂交水稻亲本以及组合中是否混杂其他品种的分子检测标记，对于还未筛选出特异分子标记的材料，可以进一步增加SSR标记筛选数，开发出特异性强的快速鉴定品种真实性和纯度的理想分子标记。

根据目前我国在生产上应用的主要不育系、父本以及近10年的杂交组合，构建我国杂交水稻数字分子指纹信息库，并建立网络化公共服务平台，让所有杂交水稻育种工作者能利用该服务平台开展杂交水稻亲本资源创新和虚拟配组，以评价其新材料的遗传多态性以及所配组合的遗传类型，这可能对杂交水稻育种产生重大促进作用。

4 结论

本研究建立了94份杂交水稻亲本的数字分子指纹库，供试材料间具有3个以上的遗传差异位点。筛选出23个材料的特异数字分子标记，这些特异数字分子标记可应用于种子真实性或纯度的快速分子鉴定。根据供试的不育系和父本的数字分子指纹建立了虚拟杂交水稻F1代的数字分子指纹库和虚拟组合的特异数字分子标记。

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Research on DNA Molecular Digital Fingerprint Database Based on 48 Pairs of SSR Primers for 94 Hybrid Rice Parents in NYT 1433-2014

LIN Yi-xia, WANG Zi-xin, LIU Huan, WANG Zheng, LIANG Man-zhong, DAI Xiao-jun*, CHEN Liang-bi*

(CollegeofLifeScience,HunanNormalUniversity,Changsha410081,China;*Corresponding author, E-mail: hello_dxj@163.com， chenliangbi@126.com)

It is of great significance to establish the simple molecular fingerprinting technique with high resolution for identification of the genetic polymorphism and the authenticity of different rice varieties, so as to guide rice breeding and regulate its seed market. The new standards of technical regulation on identification of the rice varieties with SSR markers, formulated by the Ministry of Agriculture of P.R. China, recommended the use of 35 control standard

amples with different genetic characteristics for identification of rice varieties. The genetic polymorphism and specificity of 94 hybrid rice parents were compared based on the standard method. The results indicated that the tested varieties differed at least three pairs of mutated loci or the genetic differences between the parents of hybrid rice could been well distinguished. By comparing the polymorphism of the 48 recommended primers of the new standard, 46 primers showed higher polymorphism except RM176 and RM551. Thus, higher polymorphic alternative molecular markers would be identified in other loci of the same chromosome. 16 new allelic variation sites were found and could be used as supplementary of standard fingerprint database and enrich genetic variation sites information. By analyzing molecular fingerprint of 94 hybrid parental materials, 23 have specific molecular markers and can be used in authenticity analysis of hybrid combination and purity identification of hybrid seeds. According to the digital molecular fingerprint of the tested rice parent, we constructed a virtual digital molecular fingerprint database including 87 female sterile lines and 7 male parents, and specific digital molecular marker of virtual hybridized combination authenticity and rapid seed purity identification.

hybrid rice; SSR primer; digital fingerprint

2015-12-29； 修改稿收到日期: 2016-03-12。

国家自然科学基金资助项目(3147430)； 生态学重点学科资助项目(0713)。

Q755; S511.01

A

1001-7216(2016)06-0593-10

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