乌司他丁预先给药对双下肢缺血再灌注损伤后血浆细胞因子的影响

王乃田,于明军,刘理金，屠伟峰



乌司他丁预先给药对双下肢缺血再灌注损伤后血浆细胞因子的影响

王乃田1,于明军2,刘理金3，屠伟峰4

目的 探讨乌司他丁预先给药对双下肢缺血再灌注损伤后血浆细胞因子的影响。方法 30例择期双下肢需上止血带(>150 min)手术的患者，随机分为：对照组(NC组，n=10)、乌司他丁预先给药组(UP1组，n=10)和乌司他丁治疗组(UP2组，n=10)。UP1组于首次上止血带前15 min静脉滴注乌司他丁按6000 U/kg，末次松止血带前15 min再次静脉滴注6000 U/kg；UP2组末次松止血带前15 min给予乌司他丁静脉滴注12 000 U/kg；NC组：末次开放止血带前15 min静脉滴注等容积生理盐水(均10 min内滴完)。3组患者首次上止血带前20 min(缺血前)、末次松止血带后30 min(再灌注后30 min)及术后(再灌注后)1 d、3 d和7 d ，取外周血检测血浆C反应蛋白(CRP)、白介素-6(IL-6)、和肿瘤坏死因子(TNF-α)水平。结果 与缺血前比较，再灌注后30 min、1 d及3 d，3组患者血浆CRP、IL-6、TNF-α水平均显著升高(P<0.05)，但UP1组、UP2组与NC组相比明显低于后者[CRP：1 d(11.15±2.32)、(10.48±2.08) mg/l比NC(15.83±4.56)mg/l，3 d (4.29±1.89)、(3.89±1.34) mg/l比NC(6.78±2.95)mg/l；TNF-α：1 d(31.24±8.66)、(29.72 ±8.77) ng/l比NC(44.802 ±11.70)ng/l，3 d (13.75±5.11)、(15.73±4.16)ng/l比NC(20.787±8.05)ng/l；IL-6：1 d(160.80±46.95)、(179.72±35.77)ng/l比NC(329.50±95.34)ng/l，3 d (45.32 ±16.53)、(53.35±17.62)ng/l比NC(79.33±24.93)ng/l，P<0.05]，UP2组与UP1组间比较差异均无统计学意义；再灌注后7 d 3组患者血浆细胞因子均恢复正常。结论 乌司他丁预先给药可有效地减轻双下肢缺血再灌注所引起的全身炎性反应，使血浆CRP、IL-6、TNF-α上升幅度明显受抑，从而可有效地阻抑炎性因子介导的组织器官损伤。

乌司他丁；双下肢；缺血再灌注损伤；细胞因子

肢体缺血再灌注损伤是临床常见的病理过程，各种原因造成的组织血液灌流量减少均可使细胞发生缺血性损伤，当恢复血液再灌注后，部分患者的细胞功能代谢障碍及结构被破坏反而更加严重，即再灌注损伤(ischemia reperfusion injury, IRI)[1]，它往往会加重组织细胞功能代谢障碍及结构破坏。目前，缺血再灌注损伤所造成的远离器官损伤，即非缺血区域组织器官损伤的现象日益引起人们的关注[2]。研究显示，乌司他丁在体外循环、创伤打击等条件下对于脏器保护有显著的效果，乌司他丁可抑制炎性介质释放，预防细胞因子级联反应，抑制白细胞过度激活及炎性介质的释放，阻断细胞因子炎性介质与白细胞之间的恶性循环作用，减轻各种蛋白酶对机体组织器官功能的不良反应[3]。本研究拟观察乌司他丁对止血带引起的双下肢缺血再灌注后血浆炎性细胞因子水平的影响。

1 对象与方法

1.1 对象 双下肢需上止血带的择期手术患者30例，均为男性，年龄18～70岁[美国麻醉师学会(ASA)Ⅰ级]，随机编入3组中：正常对照组(NC组，n=10)、乌司他丁预先给药组(UP1组，n=10)和乌司他丁治疗组(UP2组，n=10)。UP1组：于首次上止血带前15 min静脉滴注乌司他丁(商品名：天普洛安，广东天普生化医药股份有限公司)6000 U/kg，溶于100 ml的生理盐水中，10 min内静脉滴注完，并于末次松止血带前15 min，再取 6000 U/kg溶于100 ml的生理盐水中，10 min内静脉滴注完；UP2组：末次开放止血带前15 min给予乌司他丁12 000 U/kg，溶于100 ml的生理盐水中，10 min内静脉滴注完；NC组：末次开放止血带前15 min给予等容积生理盐水静脉滴注。所有患者术前均无高血压、冠心病、免疫性疾病及肝肾功能不全史；1周内未使用激素和抗生素；超声心动图示无心律不齐、异位心率、ST段改变；所有生化检查均未见异常；排除6个月内心肌梗死；近6个月来曾服用免疫抑制或免疫活性药物，以及近期有发热或明确感染者；并且排除止血带时间短于150 min、不符合腰麻/硬膜外穿刺要求的患者，术后均使用静脉自控镇痛。

1.2 麻醉方法 术前常规禁食(8～12 h)，术前30 min肌肉注射苯巴比妥钠0.1 g+东莨菪碱0.3 mg；患者选择L2～3间隙行椎管内穿刺，从腰麻针内缓慢注入0.75%布比卡因2 ml+10%葡萄糖1 ml混合液(2±0.2) ml，麻醉平面上限控制在T10～11范围，术中根据需要硬膜外适当追加药物，静脉未给任何镇静、镇痛药物。3组患者先自右下肢远端用驱血带驱血后，至大腿中上1/3上电脑止血带(德国VBM 1000型)，压力为80 kPa左右止血带加压止血。待右膝手术完成后，按同样方法上左下肢止血带。

1.3 标本采集 分别于首次上止血带前20 min(缺血前)、末次松止血带后30 min(再灌注后30 min)、术后(再灌注后)1 d、3 d和7 d于非输液侧肘静脉抽血5 ml，3000 r/min离心15 min，分离血清，-70 ℃分装保存待测血浆细胞因子。

1.4 检测方法 IMMAGE免疫化学自动分析系统测定CRP(免疫化学发光法，BECKMAN COULTER公司产专用试剂盒)，ELISA法测定TNF-α、IL-6(北京福瑞生物工程公司提供试剂盒)。

2 结 果

2.1 一般资料 3组患者性别、年龄、体重、手术时间、止血带压迫时间以及失血量和输血量均差异无统计学意义(P>0.05，表1)。

2.2CRP的变化 在再灌注后30min、1d和3d，NC组血浆CRP水平明显高于缺血前(P<0.05)，UP2组和UP1组也明显升高，但与NC组相比明显低于后者(P<0.05)，UP2组和UP1组间比较差异无统计学意义，再灌注后7d3组CPR均恢复正常(表2)。

组别年龄(岁)体重(kg)左侧止血带时间(min)右侧止血带时间(min)输血量(ml)失血量(ml)手术时间(min)NC组51±1467±1186±785±81100±469850±141210±20UP1组47±1770±1689±589±61033±3881100±545197±32UP2组57±1164±891±987±81025±4331000±400214±14

表2 双下肢缺血再灌注对血浆C-反应蛋白的影响 (n=10；mg/L；

注：与NC组比较,①P<0.05；与缺血前20min比较，②P<0.05

2.3TNF-α的变化 再灌注后30min、1d、3d，NC组血浆TNF-α水平均明显高于缺血前(P<0.05)，UP1组、UP2组与NC组比较，明显低于NC组(P<0.05)；UP2组和UP1组间比较差异无统计学意义(表3)。

2.4IL-6的变化 在再灌注后30min、1d、3d，NC组血浆IL-6水平明显高于缺血前(P<0.05)，以再灌注后1d最高，UP1组、UP2组血浆IL-6水平也明显升高，但与NC组比较，明显降低(P<0.05)。UP1组与UP2组比较差异无统计学意义(表4)。

表3 乌司他丁对肿瘤坏死因子的影响 (n=10；ng/L；

注：与NC组比较,①P<0.05；与缺血前20min比较，②P<0.05

表4 乌司他丁对白介素-6的影响 (n=10；ng/L；

注：与NC组比较,①P<0.05；与缺血前20min比较，②P<0.05

3 讨 论

组织器官缺血时，机体受损组织局部或全身可迅速发生炎性反应，CRP、IL-6和TNF-α是重要的炎性介质。CRP是第一个被认为是急性时相反应的蛋白，在急性反应及组织损伤时其血浆浓度急剧升高，是反映手术应激程度的重要指标，而且其浓度的高低与组织损伤程度具有明显的相关性[4]。因此CRP已广泛应用于各种炎性反应、损伤过程的判断和监测。IL-6是具有多种生物活性的细胞因子，它能诱导急性期炎性反应的产生，促进多种免疫细胞的分化及活化，分泌免疫因子。有研究报道，接受择期大手术的患者，切皮后30min，即可测到血浆IL-6水平升高，术后2～4h较术前相比差异非常显著；接受择期中等手术的患者，切皮后2～4h其血浆IL-6水平升高，并于术后4～6h达到峰值，持续时间约为48～72h。研究表明，IL-6在血浆中的浓度与手术所致的创伤大小有关[5]。TNF-α是一种自分泌的作用因子，在缺血再灌注损伤、脓毒症、慢性心功能不全、病毒性心肌炎以及心脏移植排斥反应中均可导致心肌机能障碍和心肌细胞坏死[6]。TNF-α可直接损伤血管内皮细胞，免疫粘附、激活中性粒细胞产生多种活性物质导致组织器官损伤。在炎性介质的释放过程中，TNF-α可能起着核心作用，其可诱导IL-6及其他继发性炎性介质的释放与激活，导致炎性反应逐步放大。

炎性反应在组织器官的损伤中起着重要作用。炎性细胞是早期组织细胞损伤的启动步骤，炎性反应产物则促进了细胞损伤的进程。在炎性反应时，单核细胞及活化内皮细胞产生IL-6，刺激机体产生CRP，同时CRP具有与IgG和补体相似的调理及凝集作用，促使巨噬细胞的吞噬功能，刺激单核细胞表面的细胞因子表达及其他免疫调节，因此炎性介质的升高对于围术期组织器官功能具有一定的负性作用。

乌司他丁是从人尿中提取的由143个氨基酸组成的广谱蛋白水解酶抑制药，抑酶活性强，对于多种水解酶有抑制作用。作为广谱蛋白酶抑制药，乌司他丁在临床应用中，显示了对急性胰腺炎、急性循环障碍等疾病的良好治疗效果[7-9]。近年来临床研究发现，其在抵御手术刺激，抑制围手术期多种炎性介质的释放，保护重要脏器功能等方面作用显著[5,10]。有研究报道，将乌司他丁应用于心脏外科手术患者，能有效地抑制体外循环围术期促炎细胞因子的释放和氧自由基对机体的损伤，并有利于术后循环功能的恢复[11]。

本实验中，3组患者在再灌注后30min，即可见血浆CRP、IL-6和TNF-α明显升高，并于再灌注后1d达到峰值。UP1组、UP2组患者在使用了乌司他丁后，血浆细胞因子虽具有同样的上升趋势，但与NC组相比受到明显抑制。再灌注后30min，UP1组、UP2组的细胞因子水平便显著低于NC组，并且一直维持至再灌注后第3天。结果显示，围术期双下肢缺血再灌注后血管内皮的炎性改变，这可导致包括CRP、IL-6和TNF-α在内的急性炎性蛋白反应性升高，而乌司他丁预先给药对炎性因子的表达具有良好的调控作用，从而起到了抑制炎性过程的级联反应和细胞因子的产生，减轻微血管壁的损伤，防止炎性反应对重要脏器损伤的作用。 双下肢IRI患者围术期促炎细胞因子IL-6、TNF-α和CRP的表达显著增强，且各因子之间相互作用，炎性反应进一步放大，乌司他丁一方面对此类炎性因子具有抑制作用，另一方面可阻断炎性因子的相互激活，从而可有效地保护肢体再灌注后对组织器官的损伤。本研究还发现乌司他丁对所测因子的作用以术后第1天最显著，第7天与对照组无明显差别。由于乌司他丁的半衰期较短，仅为40min左右，因此对术后炎性因子的作用，用药时机、方式和剂量是否适宜肢体缺血再灌注的保护剂量，仍需继续研究探讨。

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(2015-11-06收稿 2016-06-20修回)

(责任编辑 岳建华)

Effects of ulinastatin on cytokines level in plasma following the both lower extremities ischemic reperfusion

WANG Naitian1,YU Mingjun2, LIU Lijin3, and TU Weifeng4.

1.Department of Anesthesiology, General Hospital of Chinese People’s Armed Police Force, Beijing 100039, China;2.The Medical Team of the Detachment Three of Hebei Province Corps,Chinese People’s Armed Police Force, Qinhuangdao 066100, China; 3.Graduate School,Jinzhou Medical University 121001, China；4.Department of Anesthestiolgy,Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command, Guangzhou, 510010, China

Objective To investigate the effects of ulinastatin (UTI) on plasma cytokines following intermittent continuous ischemic reperfusion(IR, cumulative time >150min ) of both lower extremities.Methods Thirty patients, both low extremities bound with tourniquets during operation, were randomly divided into three groups: normal control group(Group NC), UTI pretreatment group 1(Group UP1) and group 2(Group UP2). The patients in Group UP1 were intravenously infused with UTI 6000 U/kg 15 min before the tourniquet application and the last tourniquet loosening, respectively. The patients in Group UP2 were intravenously infused with UTI 12 000 U/kg 15 min only before the last tourniquet loosening, UTI was diluted with 100 ml sodium chloride and infused intravenously within 10 minutes. The patients in Group NC were administered with the same volume sodium chloride. At the time, 20 min before tourniquet apptionhor(before IR); 30 min after last tourniquet lossening(30 min after IR); and 1 d, 3 d, 7 d after IR, the peripheral blood was sampled to measure plasma levels of C reactive protein(CRP), interleukin-6(IL-6), and tumor necrosis factor-α(TNF-α).Results The levels of CRP, IL-6 and TNF-α in the three groups all rose significantly 30 min, 1 d and 3 d after IR compared with those before IR respectively(P<0.05). But the levels of the cytokines in Group UP1 and UP2 were significant lower than those in Group NC[CRP：1 d(11.15±2.32)、(10.48±2.08)mg/lvsNC(15.83±4.56)mg/l，3 d (4.29±1.89)、(3.89±1.34)mg/lvsNC(6.78±2.95)mg/l；TNF-α：1d(31.24±8.66)、(29.72 ±8.77)ng/lvsNC(44.802 ±11.70)ng/l，3 d (13.75±5.11)、(15.73±4.16)ng/lvsNC(20.787±8.05)ng/l；IL-6：1 d(160.80±46.95)、(179.72±35.77)ng/lvsNC(329.50±95.34)ng/l，3 d (45.32 ±16.53)、(53.35±17.62)ng/lvsNC(79.33±24.93)ng/l，P<0.05]. There were no significant differences between Group UP1 and Group NC in each time in terms of the cytokines(P>0.05). The inflammatory cytokines recovered to the same level 7 d after IR.Conclusions UTI pretreatement may relieve the system inflammatory reaction following both low extremities, prevent the increases of plasma cytokines after IR, thus may attenuate organ damage mediated by cytokines.

ulinastatin；both low extremities；ischemic reperfusion injury；cytokines

广州科技计划项目(200821-E421)

王乃田，博士，主治医师。

1.100039 北京，武警总医院麻醉科，2.066100 秦皇岛，武警河北总队第三支队卫生队，3.121001，锦州医科大学研究生院，4.510010，广州军区广州总医院麻醉科

屠伟峰，E-mail：wftuyx02@163.com

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